генна розчинів: для розчинів натрію гідрокарбонату 1 мл / кг маси тіла тварини; глюкози 5 і 10% концентрації - 10 мл / кг (у вигляді 5% розчину), 20 і 40% концентрації - 10 мл / кг (у вигляді 10% розчину); для сольових розчинів: «Хлосоль», «Трисоль», «Квартасоль», «Квінтасоль», Рінгера - Локка та інших - 10 мл / кг маси тіла тварини.
Розглянутий метод має ряд істотних недоліків: необхідність утримувати велику кількість піддослідних тварин, значні коливання чутливості кроликів до пірогенів, висока вартість аналізу.
9.2 Лімулус-тест (LaL-тест)
В даний час найбільш перспективним методом випробування на пірогенність можна вважати лімулус-тест (LaL-тест). Метод заснований на здатності лу клітин (амебоцитів) крові крабів Limulus poliphemus реагувати з бактеріальними пірогенними ендотоксинами, утворюючи гель.
Лізат амебоцитів Limulus (LaL) отримують таким чином. Відбирають голкою кров краба, поміщають її в буферний розчин. Відокремлюють центрифугуванням амебоцити, які є єдиними клітинами крові краба, відмивають їх гіпертонічним розчином натрію хлориду, а потім лизируют, додаючи дистильовану апірогенну воду. Отриманий LaL, що зберігається при +40 С, стійкий протягом 9 місяців.
Лімулус-тест проводять, змішуючи в асептичних умовах у пробірці 0,1 мл випробуваного розчину з 0,1 мл LaL. Суміш інкубують при 370 С протягом від 15 до 90 хв при рН від 6,0 до 8,0, не піддаючи її струшуванню. При наявності пірогенних ендотоксинів грамнегативних бактерій утворюється гель, який виявляється по збільшенню в'язкості суміші, втрати нею плинності. При повороті пробірки на 1800 гель не повинен руйнуватися.
Лімулус-тест вже в 1980 р. включений в ХХ фармакопею США поряд з тестом на кроликах. Його перевагою є висока чутливість, що дозволяє в певних умовах виявляти до 1 нг ендотоксину. Метод в 5 - 10 разів чутливіші, ніж тест на кроликах. Він легко відтворюється, надійний і економічний. Тест широко використовується для контролю пірогенності води, вимагаючи для проведення від 20 до 90 хв, добре корелює з тестом на кроликах. Застосування цього методу дозволяє дуже швидко і своєчасно, до використання розчинів в клініці, отримати результати аналізу на їх пірогенність.
Запропоновано також нова модифікація лімулус-тесту, проведеного в капілярі із застосуванням усього 1 мкл реагенту замість 0,1 мл при пробирочную методі. Для прочитання результату капіляр з реакційною сумішшю занурюється вертикально в забарвлений розчин. Якщо гель утворився, то розчин не надходить у капіляр, і, навпаки, при відсутності пірогенів забарвлений розчин заповнює капіляр.
Капілярний варіант лімулус-тесту дозволяє визначити дуже малі кількості ендотоксину, наприклад у випадку E. Coli - до 0,02 нг / мл.
Особливу цінність лімулус-тесту представляє для визначення пірогенів в препаратах, які не можуть бути перевірені офіційним тестом внаслідок того, що вони підвищують температуру у кроликів (метиленовий синій, сполуки, що містять іон фосфату та ін) або, навпаки, знижують її (анестетики, кортикостероїди, антипірин, фенотіазини та ін), а також у разі короткоживучих радіофармацевтичних препаратів.
До недоліків лімулус-тесту відноситься вплив на нього деяких лікарських речовин, уповільнюють або прискорюють освіту гелю. Так, новокаїн, гексаметилентетрамін інгібують цю реакцію, а розчини калію хлориду, натрію лактату прискорюють її, що веде до отримання помилкових результатів. У зв'яз...
