ічної реакції з утворенням продукту, який визначається колориметричним, хемілюмінесцентним, флюоресцентним методами детекції. Кількість білка може бути оцінено за допомогою денситометрії. Високий ступінь дозволу досягається за рахунок електрофоретичного розділення білків і специфічності моноклональних антитіл. У оптимально відпрацьованих умовах Вестерн-блот можна виявляти антиген в кількостях менше 1нг.
Етапи иммуноблоттинга:
. Поділ білків методомгель-електрофорезу
. Перенесення білків на мембрану
. Блокування
. Детекція
. Поділ білків методом гель-електрофорезу. Найбільш поширений спосіб поділу білків - електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (англ. SDS) за методом Леммлі. Підлягають аналізу білки у присутності додецилсульфату натрію набувають однаковий негативний заряд, що робить можливим їх поділ залежно тільки від молекулярної маси. Попередньо денатуровані білки вносять в кишені «треків» (доріжок) акріламідного гелю з низькою концентрацією (концентрує гель), що дозволяє їх сконцентрувати перед переходом в розділяє гель (з більш високою концентрацією), де відбувається поділ білків в залежності від молекулярної маси. Білки мігрують в електричному полі через акріламідний гель до анода, при цьому білки меншого розміру рухаються швидше. Як правило, одну з «доріжок» залишають для маркерів молекулярної маси (суміші білків з відомими масами). Відмінності у швидкості просування - електрофоретичної рухливості призводить до поділу білків на смуги. Концентрація акриламіду визначає роздільну здатність гелю - чим вище концентрація акриламіду, тим краще поділ низькомолекулярних білків. Низька концентрація акриламіду покращує роздільну здатність гель-електрофорезу для високомолекулярних білків.
. Перенесення білків на мембрану. У методі електроблоттінга перенесення білків з гелю на мембрану (виготовлену з нітроцелюлози або полівініліденфториду (англ. PVDF) відбувається під дією електричного струму. Білки переміщаються з гелю на мембрану із збереженням свого розташування. В результаті цього процесу (від англ. Blotting-промокання) білки опиняються в тонкому поверхневому шарі мембрани і доступні для подальшого зв'язування з антитілами. Обидва варіанти мембран використовують через їх властивості неспецифічно пов'язувати білки. Зв'язування білків засноване як на гідрофобних взаємодіях, так і на електростатичних взаємодіях між мембраною і белком.Эффективностьэлектроблоттинга значно підвищується при використанні системи Транс-блотTurbo, що дозволяє істотно зменшити час перенесення білків з гелю на мембрану (7хв проти 2 годин). У зв'язуванні комплексу білок-SDS з нітроцелюлозній мембраною беруть участь в основному сили електричної природи, причому дана взаємодія є многоточечним і призводить до «распластиванія» білків на поверхні мембрани. Таким чином, після електроперенесення ми отримуємо на нітроцелюлозі репліку гелю з білками, розташованими так само, як і в поліакриламідному геле.Еффектівность перенесення білків з гелю на мембрану може бути перевірена фарбуванням мембрани барвниками Coomassieblue або Ponceau S. Переважно використовується барвник Ponceau S, який володіє більшою чутливістю і краще розчинний у воді, що спрощує подальшу відмивання і нанесення антитіл.
. Блокування. Блокування неспеци...
