ід залишків ДНК у присутності 1-кратного буфера для ДНКази I. Реакційну суміш інкубували при 37 Вє С протягом 1 ч. РНК осаджували з реакційної суміші надлишком етанолу в присутності ацетату натрію. Осад розчиняли воді. Вимірювали оптичну щільність очищеної РНК.
Готували водний розчин суміші РНК і В«гексапраймераВ» і інкубували його протягом 3 хв при 70 Вє С, потім 1,5 хв в льоду. Після цього до суміші додавали інші компоненти (буфер для ВІД, dNTP, DTT, ревертаза MuMLV). Концентрації компонентів в РС наведено в табл. 4.
Таблиця 4. Склад РС для ВІД. p align="justify"> КомпонентКонцентрація або кількість у РСБуфер для ОТ1 хdNTP1 мМDTT5 мМ В«ГексапраймерВ» 25 мкМMuML-V40 е.а.РНК2 мкг
РС інкубували 10 хвилин при кімнатній температурі, потім 1 годину при 42 Вє С, потім, для гідролізу залишків РНК , 10 хвилин при 70 Вє С. Якість отриманої кДНК оцінювали методом ПЛР з використанням специфічних пар праймерів.
2.10 Проведення полімеразної ланцюгової реакції
ампліфікації виробляли з використанням кДНК-матриці і специфічної до неї пари праймерів. Готували реакційну суміш, що містить dNTP, прямий і зворотний праймери, Taq-полімеразу і ДНК-матрицю у присутності 1-кратного буфера для ПЛР. Реакційну суміш поміщали в термоциклер В«ТерцикВ» фірми В«ДНК-ТехнологіяВ» (Росія) з встановленою програмою зміни температури: 1 цикл: 94 Вє С, 3 хв, потім 27 циклів: 94 Вє С, 45 с, Т відпалу (варіюється в різних експериментах), 30 с, 72 Вє З , 30 с, і останній цикл: 72 Вє С, 2 хв. Візуалізацію проводили методом електрофорезу в агарозному гелі.
2.11 Підбір умов проведення ПЛР з парами праймерів EGFP-1, 2, EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6
2.11.1 Порівняння ефективності ампліфікації при використанні пар праймерів EGFP-1, 2, EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6
Праймери EGFP-1, 2,3,5,6 були підібрані за допомогою програми Primer 3.
При порівнянні ефективності ампліфікації при використанні пар праймерів EGFP-1, 2, EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6 в якості ДНК-матриці використовували кДНК BHK, отримана шляхом зворотної транскрипції сумарною РНК, виділеної з клітин лінії BHK і очищена від ДНК ДНКаза I. Як негативний контроль бралася вода. Ампліфікацію ...
