А методи порівняно прості у виконанні, не вимагають значних тимчасових витрат (час реакції від моменту взяття матеріалу до отримання відповіді становить 1.5 - 3.5 години). Однак для їх виконання необхідний комплект обладнання для проведення ІФА (інкубатор, шейкер, вошер, рідер і набір автоматичних Мікродозатори), відповідне приміщення та підготовка медичного персоналу. Діагностична значимість (специфічність і чутливість) ІФА при урогенітальному хламідіозі становить 50 - 70% по порівняно з культуральним методом.
B. РИФ
Реакція імунофлюоресценції заснована на взаємодії противохламидийной АТ з родоспеціфіческому хламидийним антигеном. Існує два типи реакції імунофлюоресценції - прямий і непрямий. У першому випадку безпосередньо специфічне антитіло мечено флюорохромом і реакція проходить в один етап, що значно скорочує терміни дослідження. У другому випадку специфічне антитіло не має мітки, а для виявлення комплексу АГ-АТ, що утворився на першому етапі, використовують другі мічені антитіла, специфічні до антихламідійний антитілам. Результат реакції оцінюють візуально за допомогою люминисцентного мікроскопа.
Крім імпортних з'явились вітчизняні набори для діагностики хламідійної інфекції реакцією прямої імунофлюоресценції, які практично не поступаються за специфічності і чутливості, але мають значно нижчу ціну.
Матеріалом для дослідження служать мазки-відбитки, приготовані з дотриманням правил. Мазки для РИФ готуються на спеціальних деколірованних стеклах в межах обмеженою майданчика діаметром 8 - 10 мм. Після цього їх висушують на повітрі і фіксують, занурюючи на 5 - 10 хвилин в холодний 96% (краще абсолютний) етиловий спирт або наносячи на препарат 0.1 - 0.15 мл охолодженого безводного ацетону до повного його випаровування. Фіксовані препарати можна досліджувати відразу або при необхідності зберігати при кімнатній температурі протягом доби або при -20 В° С протягом 2 тижнів (при цьому необхідно виключити доступ вологи при зберіганні і доведенні препарату до кімнатної температури перед дослідженням за допомогою поліетиленового пакета і силікагеля).
При проведення прямої РІФ на препарат наносять розчин мічених антитіл у кількості, необхідному для повного покриття мазка (25 - 30 мкл). Препарат інкубують горизонтальному положенні у вологій камері протягом 15 хвилин при +37 В° С. Підсихання реагенту неприпустимо щоб уникнути хибнопозитивних результатів. Далі мазок промивають в проточній воді 30 сек, прополіскують в дистильованої воді, висушують і готують до мікроскопії.
При проведенні непрямої РІФ на препарат наносять необхідну кількість розчину антихламідійний антитіл і проводять першу інкубацію в тих же умовах, що і при проведенні прямої РІФ. Потім препарат промивають, висушують на повітрі і наносять другий реагент - мічені антитіла до хламидийним АТ і проводять другу інкубацію так само у вологій камері при +37 В° С 15 хвилин. Після промивання препара т висушують і готують до мікроскопії. Готові препарати рекомендується переглядати відразу. При необхідності можливе зберігання забарвлених препаратів протягом 1 - 2 діб при +2-8 В° С в темному місці без доступу вологи.
Мікроскопію проводять з використанням імерсійної системи. Можливі два варіанти імерсійною мікроскопії:
1. Масляна іммерсія: На готові висушений препарат наносять 20 - 25 мкл Монтується рідини (гліцерин, забуферений фосфатним буфером з рН 7.2 - 7.6), покривають його знежиреним покривним склом, на яке потім наносять краплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла і мікроскопують об'єктивом (маркування "Л" - люмінісцентний) із збільшенням 90 і окуляром із збільшенням 5. p> 2. Водна іммерсія: на готовий препарат наносять краплю 20 мкл фосфатного буфера з рН 7.4 і мікроскопіруют об'єктивом для водної імерсії (маркування - біла смуга і "Л" - люмінісцентний) із збільшенням 60 і окуляром із збільшенням 5. Водна іммерсія дає більш рівне, яскраве і чітке світіння. p> РІФ дозволяє виявляти антигенні структури як елементарних, так і ретикулярних тілець. ЕТ розташовані здебільшого позаклітинно, округлої форми з рівними краями, дрібні (розмір 1:100 - 1:150 по відношенню до оточуючих їх клітинам), однорідної структури, мають яскраве специфічне смарагдово-зелене свічення, яке при роботі мікрогвинти може давати дифракційні кільця (кільця Ділекторского). РТ зустрічаються значно рідше, розташовуються переважно внутрішньоклітинно, мають менш однорідну структуру, більш поліморфні, але також з чіткими краями і володіють яскравим специфічним смарагдово-зеленим світінням. Будь інший флюоресцирующий матеріал неправильної форми, нерівними нечіткими краями, що має неяскраву зелене забарвлення, або світіння іншого кольору відноситься до артефактів. Інтенсивність, яскравість і відтінок специфічного світіння залежить від рН монтують рідини або буфера використовуваного для мікроскопії. Велика інтенсивність світіння ФИТЦ в лужному середовищі збільшує чутливість методу, але веде до ...
