ура проміжного геному показана в дужках. Х означає гомологичную рекомбінацію. Геномна послідовність pBR322 представлена ​​жовтим (частина, яка містить ген b-лактамази) і синім (частина, яка містить ген стійкості до тетрацикліну) заштрихованими боксами розділеними сайтом для клонування. Гени резистентності позначені заштрихованим колом (Хлорамфенікол), незаштриховані кругом (еритроміцин), заштрихованим трикутником (тетрациклін), заштрихованим ромбом (спектиноміцин). Вигнута стрілка позначає супрессию промотора Pr продуктом гена CI. [I] означає сайт для рестриктази I- Ppo I. br/>
У LPA плазмідах між двома LPS знаходився ген cI, кодує репрессор CI, і ген стійкості до спектиноміцину; між тетрациклінової частиною pBR322 і правим LPS знаходився ген стійкості до хлорамфеніколу. LPA плазміди були приготовлені в E. coli і потім трансформувалися в BEST7003. В результаті трансформанти (LPA штами) ставали чутливими до неоміцину (репресованого cI) і набували стійкість до спектиноміцину і хлорамфеніколу (маркери з LPA). Далі LPA штами трансформувалися препаратом геному дикого штаму Synechocystis PCC6803. Вставка частини геному Synechocysti s заміняла фрагмент cI-spcR, в результаті чого дерепрессіровался neo і губився маркер стійкості до спектиноміцину. Тому клони стійкі до неоміцину і чутливі до спектиноміцину несли потрібну вставку. p> Таким чином, були клоновані три сегмента геному Synechocysti s : A, B і C довжиною 26 -, 38 -, 43-kb відповідно). Для кожного сегмента створювалися свої LPS, LPA плазміди і LPA штами. Спроби клонувати сегменти довші 50 kb виявилися безуспішними. p> Тому в іншій серії експериментів був використаний метод прямий селекції (рис.13), який також був застосований для кількісної оцінки залежності ефективності клонування від розміру вставки. З дикого штаму Synechocystis PCC6803 був отриманий мутантний штам BUSY1001, який в гені rnhB містить вставку гена стійкості до спектиноміцину. Даний маркер і використовувався для проведення прямої селекції рекомбінантов зі вставкою геному Synechocystis.
В якості BGM вектора виступав штам B. subtilis BEST6016, несучий послідовність pBR322, вставлена ​​в ген proB ( як і BEST7003), а також ген стійкості до неоміцину [ Pr- neo ], вставлений в ген yvfC (неомициновой маркер BEST6016 в даних експериментах не використовувалася). p> У LPA плазмідах між двома LPS знаходився ген стійкості до еритроміцину, і LPA штами відбирали з цього маркеру. Таким чином, були створені 4 штаму B. subtilis для клонування сегментів, що містять rnhB :: spc , довжиною від 14 до 77 kb. Після трансформації препаратом геному Synechocystis BUSY1001 йшов прямий відбір рекомбінантов по їх стійкості до спектиноміцину. Було показано, що ефективність клонування знижується зі збільшенням розміру ...
