клонируемого сегмента.
За допомогою BGM вектора BEST6016 також був клонований 120-kb фрагмент геномної ДНК миші (Itaya et al., 2000). Клонування фрагмента йшло в кілька етапів (рис.14). Спочатку в BEST6016 клонували перший фрагмент довжиною 20 kb, а потім шляхом трансформації і гомологичной рекомбінації до нього були додані декілька фрагментів, у результаті чого він був подовжений до 120 kb. Всі проведені маніпуляції були аналогічні описаним вище. p> За допомогою BGM вектора BEST7003 був клонований ген миші jumonji ( jmj ) (Kaneko et al., 2003). Даний ген має розмір близько 200 kb. Передбачалося, що з першим Інтроном довжиною 90 kb взаємодіють якісь білкові фактори, завдяки чому відбувається регуляція експресії даного гена. Щоб перевірити це, були отримані фрагменти даного интрона різної довжини. Для цього в вектор BEST7003 аналогічно описаній процедурі ввели 110 kb фрагмент гена, що включає перші два интрона. Далі за допомогою гомологичной рекомбінації була проведена серія делеций (рис.15) і були отримані кілька сегментів першого интрона різної довжини. Процес введення делеций по суті є зворотним процесу подовження фрагмента.
Частковий ДНК миші
(
p185 A21) В В В В В В
Рис.14. Об'єднання двох фрагментів ДНК миші довжиною по 25 kb в один фрагмент довжиною 50 kb. S2, S1, M1 - LPS-послідовності. BEST2257, BGM вектор BEST6016 зі вставкою першого 25 kb фрагмента. neo, ген стійкості до неоміцину, Показані наступні етапи: [1] клонування S1і S2 в плазміді похідної pBR322 (між S1і S2 розташований гени cI); [2] вставка в BEST2257 фрагментів S1і S2 разом з геном cI (, репресія гена neo продуктом гена cI). Вставка відбувається в результаті гомологичной рекомбінація по LPS-послідовності S1 і частини pBR322 послідовності; [3] заміщення cI другим 25 kb фрагментом.
У всіх вищеописаних експериментах клоновані в геномном векторі сегменти реплицироваться як частина генома B. subtilis , тому вони проявляли високу структурну і Сегрегаційні стабільність. Клонована ДНК стабільно зберігалася в геномі навіть при вирощуванні в неселективною середовищі. При цьому швидкість росту рекомбінантов зі вставкою частини геному була такою ж, як і у клітин без вставки. p>
Маркери (гени стійкості)
LPS (внутрішній ділянка вставки)
