и векторів було протестовано на цитоплазматичному білку HtpG (білок теплового шоку) і інтегральному мембранному білку FtsH (Протеаза). p align=center>
1.7. Геномні вектори Для клонування великих ділянок геному на основі генома Bacillus subtilis 168 створений геномної вектор - BGM вектор ( B acillus G eno M e вектор) (Itaya et al., 2000; Itaya et al., 2003; Kaneko et al., 2003). На відміну від плазмідних векторів, в які потрібні фрагменти ДНК вставляються шляхом безпосереднього лігування, введення вставки в BGM вектор відбувається шляхом гомологичной рекомбінації. Для цього BGM вектор повинен мати послідовності гомологічні ділянкам ДНК, фланкирующим клонируемого фрагмент. Дані послідовності, звані LPS ( L anding P ad S equences) (Itaya et al., 2000), готуються в плазміді pBR322 (або її похідних) і вставляються в pBR322 послідовність геному B. subtilis шляхом трансформації і загальної рекомбінації. LPS складають 5-10% від клонованої вставки. Вони вставляються разом з фланкіруемий ними маркером, що дозволяє надалі проводити відбір рекомбінантов. LPS разом з маркером позначені як LPA; відповідно плазміди, за допомогою яких здійснюється вставка LPA в геном (у BGM вектор), називаються LPA плазмідами, а штами B. subtilis зі вставкою LPA в геномі - LPA штамами . Вставку клонируемого сегмента в BGM вектор виробляють шляхом трансформації відповідного LPA штаму; клонируемого сегмент, укладений між двома LPS, інтегрується в хромосому шляхом гомологичной рекомбінації за обома LPS.
За допомогою даної методики були клоновані різноманітні фрагменти ДНК як прокариотического, так і еукаріотичного походження.
Так, було клоновано кілька фрагментів геному фотосинтетичної бактерії Synechocystis (Itaya et al., 2003; рис.13). Ця бактерія була обрана за двома причин: відома нуклеотидних послідовність її геному і відсутність патогенності. p> В одній серії експериментів для селекції використовувався власний маркер BGM вектора, дозволяє клонувати будь-яку ділянку геному. В якості BGM вектора виступав штам BEST7003, несучий дві вставки: 4,3-kb послідовності pBR322 в гені proB і ген стійкості до неомицину pr- neo вставлений в ген yah. Інтегрована в хромосому послідовність pBR322 складається з двох частин: 2.4-kb фрагмент включає в себе ген b-лактамази (Ген стійкості до ампіциліну) і 1.9-kb фрагмент, що включає ген стійкості до тетрацикліну. ДНК клонується між цими двома фрагментами як показано на рис.13. Експресія гена neo регулюється промотором Pr фага О», з яким здатний специфічно зв'язуватися репрессорний білок c I.
В
Рис.13. Клонування геному Synechocystis в геномної вектор B. subtilis (BGM). BEST6016 і BEST7003, геномні вектори для прямої і непрямої селекції. Структ...
