ис 15, в). Механізм реакції можна представити наступною схемою:
В
Рис.
В
Рис. 15. Механізм приєднання Піренеї-1-метиламіну до 5 -кінцевого фосфату олігонуклеотиду.
В
Рис. 16. а - хроматограмма монопіренільного похідного ODN EGFP-B; б - УФ спектри поглинання продуктів, що містяться в піках (1) і (2).
Були отримані і охарактеризовані методом затримки в гелі і УФ-спектрометрією кон'югати ODN і Піренеї-1-метиламіну. Затримка в гелі, УФ спектри та спектри флюоресценції свідчать про отримання монопіренільних похідних. p align="justify"> УФ спектр основного продукту реакції, зняті хроматографом Waters, має максимуми в області 260 нм, характерний для олігонуклеотидних частини, і 350 нм, характерний для ароматичної системи залишку пірену. Спектри кон'югатів різних ODN аналогічні (див. рис. 14)
Аналіз продуктів методом електрофорезу в ПААГ в денатуруючих умовах показав зелене флюоресцентних світіння бенду в гелі, характерне для піренових кон'югатів, і невелику затримку кон'югатів в гелі у порівнянні з вихідними олігонуклеотидами, що характерно для монопроізводних (див. рис . 17).
В
Рис. 17. Зміна рухливості в ПААГ монопіренільних кон'югатів олігонуклеотидів: 1 - вихідний ODN, 2 - ODN без 5 -кінцевого фосфату, 3 - піренільний кон'югат
3.2 Порівняння ефективності виділення РНК з клітин методом хлороформ-фенольної екстракції і за допомогою набору Gen Elute в„ў Mammalian Total RNA Kit В»фірмиВ« Sigma В»
Були отримані суспензії клітин лінії R1198, що містять по 3,6 10 6 клітин. З кожної суспензії клітин виділяли В«сумарнаВ» РНК обома методами і порівнювали ефективність виділення. Критеріями ефективності виділення служили поглинання на довжині хвилі 260 нм (кількісна характеристика) і ставлення оптичної щільності на довжинах хвиль 260 нм і 280 нм (для чистої РНК воно має бути близько до 1,8).
В обох випадках на агарозному гелі після проведення в ньому електрофорезу була отримана якісна картина (див. рис. 19), характерна для В«сумарноюВ» РНК:
В
Рис. 19. Поділ В«сумарноюВ» РНК електрофорезом в агарозному гелі: 1 - 28 S рРНК, 2 - мРНК, 3 - 18 S рРНК. br/>
Спектрофотометричні дані показали більш ефективне виділення РНК набором Gen Elute в„ў Mammalian Total RNA Kit В»фірмиВ« Sigma В»у порівнянні з класичним методом хлороформ-фенольної екстракції:
Таблиця 8. Порівняння ефективності методів виділення РНК з клітин. p align="justify"> Метод виделеніяA 260 , О.Е./млA
