lign="justify"> 260 /A 280 Хлороформ-фенольна екстракція2, 21,909 Використання набору для виділення РНК9, 91,800 Таким чином, виділення методом хлороформ-фенольної екстракції програє набору для виділення РНК фірми В«SigmaВ» у плані більш значної кількості домішок ДНК, в 4,5 рази меншої кількості виділеної РНК і великих витрат часу на процес виділення.
3.3 Постановка методу ПЛР для визначення мРНК гена EGFP
Була проведена ПЛР з використанням пар праймерів EGFP-1, 2, EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6, адресованих до гену EGFP. Позитивним контролем (при використанні якого достовірно йде ампліфікація) була пара праймерів AE-7, 6, адресованих до гену AML-ETO. В якості ДНК-матриці використовували кДНК, отриману з клітин лінії R1198 і містить амплікони обох генів. На рис. 20 наведена фотографія прокрашенного бромистим етидієм агарозного гелю після поділу в ньому продуктів ПЛР. br/>В
Рис. 20. Порівняння ефективності ампліфікації з використанням пар праймерів
EGFP-1, 2 (доріжки 1,2), EGFP-3, 2 (доріжки 3,4),
EGFP-5, 6 (доріжки 5,6) і AE-7, 6 (доріжки 7,8).
В якості матриці в 2,4,6,8 використовувалася кДНК клітин лінії R1198,
, 3,5,7 - контрольні експерименти (без добавлен7ія матриці в РС).
При використанні ODN EGDP-1, 2 в якості пари праймерів ампліфікація практично не йде, має місце лише такий артефакт, як В«димери праймерівВ» (див. рис ...). Пари праймерів EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6 порівнянні за ефективності ампліфікації. p align="justify"> Потім для кожної пари праймерів EGFP-3, 2 і EGFP-5, 6 підбирали оптимальну температуру відпалу і концентрацію хлориду магнію в реакційній суміші. Позначення реакційних сумішей відповідно до умов проведення ПЛР наведені у п. 2.11.2 цієї роботи. На рис. 21 наведена фотографія прокрашенного бромистим етидієм агарозного гелю після поділу в ньому продуктів ПЛР. br/>В
Рис. 21. Порівняння ефективності ампліфікації при різних концентраціях іона магнію в РС і різних температурах відпалу. Пояснення до позначень - див. таблицю 6 у п. 2.11.2. br/>
Найбільш інтенсивно флюоресцируют бенди на доріжках 44 для EGFP-3, 2 і на доріжках 36,37 для пари праймерів EGFP-5, 6, що відповідає оптимальним умовам проведення ПЛР з використанням даних пар праймерів.
Таблиця 9. Підбір оптимальної температури відпалу і концентрації катіонів манга в РС. p align="justify"> Пара праймеровДорожкаC Mg2 + , ММТ відпалу , Вє СEGFP-3, 244561EGFP-5, 6371,559,5383 <...
