го, що структури мають слабкий контраст, вони погано виявляються в звичайному світловому мікроскопі і потрібне використання спеціальних мікроскопів (фазово-контрастні та ін.). Тому частіше застосовують спеціально оброблені препарати: фіксовані, укладені у тверду середу і пофарбовані (Юріна 1999).
Процес виготовлення гістологічного препарату для світлової та електронної мікроскопії включає наступні основні етапи:
взяття матеріалу і його фіксація,
ущільнення матеріалу,
приготування зрізів,
фарбування або контрастування зрізів.
Для світлової мікроскопії необхідний ще один етап - укладання зрізів в бальзам або інші прозорі середовища.
Фіксація забезпечує запобігання процесів розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу маленький зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під дією фіксатора в тканинах і органах відбуваються складні фізико-хімічні зміни. Найбільш істотним з них є процес незворотної коагуляції білків, внаслідок якого життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. Фіксація призводить до ущільнення і зменшенню обсягу шматочків, а також до поліпшення наступного фарбування клітин і тканин.
Ущільнення матеріалу, необхідне для приготування зрізів, проводиться шляхом просочування попередньо зневодненого матеріалу парафіном, целлоидин, органічними смолами. Більш швидке ущільнення досягається застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад, в рідкій углекислоте.
Приготування зрізів відбувається на спеціальних приладах - мікротома (для світлової мікроскопії) і ультрамікротомах (для електронної мікроскопії).
Фарбування зрізів (у світлової мікроскопії) або напилення їх солями металів (в електронній мікроскопії) застосовують для збільшення контрастності зображення окремих структур при розгляданні їх у мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні і вибираються залежно від завдань дослідження.
Гістологічні барвники (по хімічній природі) поділяють на кислі, основні і нейтральні. Як приклад можна привести найбільш уживаний барвник гематоксилін, який забарвлює ядра клітин у фіолетовий колір, і кислий барвник - еозин, що забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір. Виборче спорідненість структур до певних барвникам обумовлено їх хімічним складом і фізичними властивостями. Структури, добре забарвлюються кислими барвниками, називаються Оксифільні, а окрашивающиеся основними - базофільними. Наприклад, цитоплазма клітин найчастіше забарвлюється Оксифільні, а ядра клітин - забарвлюються базофильно.
Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними (Гетерофільні). Пофарбовані препарати зазвичай зневоднюють в спиртах зростаючої фортеці і просвітлюють в ксилолі, бензолі, толуолі або деяких маслах. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним і покривним стеклами в канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат може бути використаний для вивчення під мікроскопом протягом багатьох років (Юріна, Радостина 1999).
В електронній мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротоме, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями урану, свинцю та інших металів, після чого переглядають у мікроскопі і фотографують. Отримані мікрофотографії служать об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.
3. Методи микроскопирования гістологічних препаратів
Мікроскопія може бути світлова (з використанням світлового мікроскопа) іелектронная (з використанням електронного мікроскопа). Світлова мікроскопія може здійснюватися в світлі, коли світло проходить через тонкий прозорий гістологічний препарат, або ж у відбитому світлі, коли досліджують, наприклад, товстий або непрозорий об'єкт. Аналогічним чином, електронна мікроскопія може бути трансмісійної, коли пучок електронів проходить крізь досліджуваний ультратонкий зріз, або ж растрової, або скануючої, коли пучок електронів відбивається від поверхні досліджуваного об'єкта. У першому випадку електронний мікроскоп називається трансмісійним (ТЕМ), а в другому - сканирующим (СЕМ).
. 1 Світлова мікроскопія
Микроскопирование - основний метод вивчення препаратів - використовується в біології вже більше 300 років. Сучасні мікроскопи являють собою різноманітні складні оптичні системи, що володіють високою роздільною здатністю і дозволяють вивчати дуже тонкі деталі будови клітин і тканин. Розмір самої маленької структ...
