с з УФ-лампою): підготовка ПЛР-реагентів. p> Зона 2 (Ламінарний бокс, бокс з УФ-лампою): підготовка проб і контролів, виділення ДНК, внесення проб у пробірки з ПЛР-реагентами, проведення ампліфікації. p> Зона 3: детекція ампліфікованої ДНК. p> Проби із зони 3 заборонено переносити в зони 1 і 2, щоб уникнути контамінації ДНК-матрицею. Піпетки або наконечники повинні мати аерозольний бар'єр. Рукавички і халати необхідно міняти при переході з однієї зони в іншу.
Обладнання, необхідний для виділення ДНК:
- ламінарний бокс або стерілізуемих УФ-випромінюванням приміщення;
- одноразова пластиковий посуд (стерильні пробірки типу "Еппендорф" об'ємом 1,5; 0,5; 0,2 мл);
- автоматичні піпетки об'ємом від 0,5 мкл до 1 мл;
- змінні одноразові наконечники з аерозольними фільтрами;
- центрифуга типу "Еппендорф" з охолодженням і швидкістю не менше 10000 g;
- струшувач ("Вортекс");
Виділення ДНК з венозної крові проводять у кілька етапів:
1. У пробірку об'ємом 1,5 мл внести 300 мкл досліджуваної проби, додати 800 мкл Лізуючого реагенту і перемішати вміст пробірки перевертанням (5-10 разів). Інтенсивне струшування суміші не рекомендується. Лізуючий реагент необхідний для руйнування клітин крові та екстракції з них ДНК.
2. Термостатувати пробірку з сумішшю 5-7 хв. При температурі 65 Лљ С. Якщо виділення ДНК проводиться з твердого сухого мелкоизмельченного матеріалу, то слід термостатувати 30-40 хв.
3. Після термостатування центрифугувати пробірку з сумішшю 10 сек при 5000 об. в хв., в тому випадку, якщо суміш містить несолюбілізірованний клітинний дебрис або інший нерозчинений осад. Прозорий супернатант цілком перенести в чисту пробірку.
4. У пробірку з чистою сумішшю додати 45 мкл суспензії сорбенту NucleoS TM . Перед використанням NucleoS TM слід інтенсивно перемішати до гомогенної суспензії на вортексі. NucleoS TM необхідний для того, щоб на його частинках осіла виділена з клітин ДНК.
5. Пробірку помістити на ротатор і перемішувати 10 хв (10-20 об/хв) для кращого осідання виділеної ДНК на частинках кремнію.
6. Центрифугувати 10 сек при 5000 об. в хв.
7. Обережно, не зачіпаючи осад, видалити супернатант з допомогою водоструминного насоса.
8. До осадку додати 400 мкл лизирующие реагенту, ретельно перемішати на вортексі до повного гомогенного стану. Якщо супендірованіе утруднене (при великій навантаженні ДНК) через злипання сорбенту, то його необхідно спочатку суспендувати наконечником піпетки, а потім на вортексі.
9. Додати в пробірку 1 мл робочого розчину сольових буфера і перемішати вміст перевертанням пробірки 5-10 разів.
10. Центрифугувати 10 сек при 5000 об. в хв.
11. Обережно видалити супернатант, не зачіпаючи осад, за допомогою водоструминного насоса.
12. Повторити промивку двічі Для цього необхідно додавати по 1 мл сольових буфера, перемішувати вміст пробірки на вортексі, центрифугувати 10 сек. при 5000 об. в хв. і видаляти прозорий супернатант.
13. Просушити осад при температурі 65 Лљ С протягом 3-4 хв.
14. У цю ж пробірку внести 300 мкл ЕкстраГена Е ТМ , який необхідний для відділення промитої ДНК від частинок кремнію. ЕкстраГен Е ТМ слід відбирати від загального обсягу при постійному перемішуванні.
15. Суспендувати вміст пробірки на вортексі 5-10 сек до отримання гомогенної суспензії, потім термостатувати 4-5 хв при 65 Лљ С.
16. Ще раз суспендувати вміст пробірки на вортексі перед центрифугуванням. Центрифугувати 1 хв при 10000 об. в хв.
17. Перенести супернатант з ДНК в чисту пробірку. ДНК зберігати при температурі -20 Лљ С.
3. Проведення ПЛР
Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (In vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах (реплікації), за допомогою ПЛР амплифицируют відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ (3 kbp). З допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і за певних умовах довжина ПЛР-фрагмента може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів. Це все одно значно менше довжини хромосомної ДНК еукаріотичної клітини. Наприклад, геном людини складається приблизно з 3 млрд пар основ.
Компоненти реакції
Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні наступні компоненти:
В· ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, який потрібно ампліфікувати.
В· Два праймера, комплементарні кінців необхідного фрагмента.
В· Термостабільна ДНК-полімераза-фермент, який каталізує реакці...
