ретичної рухливістю, розташовується в анодному області;
- замикає електроліт, що містить аніони з мінімальною рухливістю, розташовується в катодній області;
- суміш електролітів аналізованої суміші, що містить аніони з проміжною рухливістю.
Якщо через цю систему пропустити електричний струм, то аніони розташуються послідовно відповідно до їх електрофоретичної рухливістю, провідний в області анода, який замикає в області катода, решта між ними у вигляді вузьких зон з чіткими концентраційними кордонами. Ширина окремих зон по завершенні процесу відповідає абсолютній кількості в суміші того чи іншого аніону.
Оскільки окремі зони розташовуються послідовно. вони практично стикаються, тому в досліджуваний зразок вносять буфер, що містить аніон з проміжною рухливістю, зона якого вбудується в отриману послідовність і розсуне зони досліджуваних аніонів. Ці допоміжні зони називаються спейсерами - роздільниками, функції яких виконують амфоліти-носії, використовувані в методі ІЕФ. особливістю методу ІТФ є те, що процес супроводжується концентруванням зон, ефект від якого призводить до вирішення, порівнянному і навіть перевершує поділ методом ІЕФ. Результати розділення сумішей методом ІТФ фіксуються на стрічці самописця у вигляді графіка вимірювання трьох параметрів:
- інтегральна крива тепловиділення: з цієї кривої можна визначити різницю температур між сусідніми зонами, що служить мірою градієнта напруженості поля, тобто різниці електрофоретичних рухливістю двох іонів
- диференціальна крива тепловиділення: довжина відрізків цієї кривої відповідають ширині зони речовини, а також служить мірою абсолютної кількості речовини в пробі
- крива поглинання в УФ-світлі: довжина відрізків цієї кривої відповідає значенню екстинкції речовини. Знаючи коефіцієнт молярної екстинкції речовини, можна визначити абсолютний вміст речовини в пробі, а також обчислити його концентрацію в зоні.
Аналітичний ізотахофорез проводять в капілярному приладі для ізотахофореза, в тефлоновому капілярі з внутрішнім діаметром 0,5 мм.
Препаративна ізотахофорез проводять в колонці з поліакриламідному гелем.
Застосування ізотахофореза
· Аналітичне поділ (мкг) пептидів, білків, нуклеотидів, органічних кислот, іонів металів (частково ізотопів) з високою роздільною здатністю.
· Препаративне поділ білків (г).
· Накопичення у вигляді вузької зони слідових кількостей речовин (мкг) з великих обсягів проби внаслідок ефекту концентрування.
· Визначення електрофоретичної рухливості.
Капілярний електрофорез
електрофорез молекулярний біологія капілярний
Капілярний електрофорез, відомий також як капілярний зональний електрофорез, використовується для розділення іонів по заряду. У разі звичайного електрофорезу заряджені молекули переміщаються в провідної рідини під дією електричного поля. У 1960х роках була запропонована методика капілярного електрофорезу для розділення молекул по заряду і розміру в тонкому капілярі, заповненому електролітом.
Обладнання
Для проведення капілярного електрофорезу потрібно відносно просте устаткування.
Основні компоненти системи - флакон для нанесення зразка, стартовий флакон, кінцевий флакон, капіляр, електроди, потужне джерело живлення, детектор і пристрій обробки даних. Флакон для нанесення зразка, стартовий і кінцевий флакони заповнені електролітом, наприклад, водним буферним розчином. Для нанесення зразка кінець капіляра опускають у флакон із зразком і потім переміщають у стартовий флакон. Переміщення аналізованих речовин здійснюється під дією електричного поля, які докладають між стартовим і кінцевим флаконами. Всі іони пересуваються по капіляру в одному напрямку під дією електроосмотичного струму. Аналізовані речовини поділяються за електрофоретичної мобільності та детектируются близько кінця капіляра.
Детектування що розділилися молекул при капілярному електрофорезі може здійснюватися різними пристроями. Найбільш поширені прилади детектируют зміна поглинання випромінювання в ультрафіолетовій області або в області видимого світла. Зазвичай в таких системах як осередку використовують ділянку капіляра. Довжина шляху проходить світла при капілярному електрофорезі становить порядку 50 мікрометрів, що набагато менше, ніж у випадку звичайних ультрафіолетових осередків, в яких довжина шляху світла порядку 1 сантиметра.
Відповідно до закону Бугера -Ламберта-Бера, чутливість детектора пропорційна довжині шляху, по якому світло проходить через ...
