осередок. Для збільшення чутливості подовжують шлях, по якому проходить світло, однак при збільшенні розмірів осередку знижується дозвіл. Капілярна трубка може бути розширена в місці детектування, такий різновид називають бульбашкової осередком. В іншому варіанті збільшення шляху проходить світла досягається за рахунок додавання додаткового капіляра. Обидва ці методи знижують ефективність розділення.
Для того, щоб відрізнити подібні зразки, системи поділу капілярним електрофорезом можуть бути безпосередньо пов'язані з мас-спектрометрами. У більшості таких систем кінець капіляра поміщають в прилад для електроаерозольной іонізації. Іонізовані частинки далі аналізують мас-спектрометрією.
Електрофорез білків
Електрофорез білків - спосіб розділення суміші білків на фракції або індивідуальні білки. Електрофорез білків застосовують як для аналізу компонентів суміші білків, так і для отримання гомогенного білка. Найбільш поширеним варіантом електрофоретичного аналізу білків, є електрофорез білків в поліакриламідному гелі.
Існує безліч різновидів і модифікацій даного методу, які використовуються в різних областях:
· Електрофорез у вільних середовищах (без підтримуючої середовища)
· Електрофорез з рухомою границею
· Капілярний електрофорез
· Зональний електрофорез в підтримуючої середовищі з капілярною структурою
· Електрофорез на фільтрувальному папері
· Електрофорез білків на ацетат-целюлозної мембрані
· Електрофорез в колонках і блоках гранульованої підтримуючого середовища
· Електрофорез білків у ПААГ
· Електрофроез білків в крохмальної гелі
· Електрофорез білків у агарозному гелі
Електрофорез білків підрозділяється також на одномірний і двовимірний (2D-) електрофорез, препаративний і аналітичний, а також електрофорез нативних білків і електрофорез у присутності детергенту. Різновидом методу електрофорезу є ізоелектричного фокусування і ізотахофорез. У разі використання імунологічних методів для виявлення розділених білків говорять про іммуноелектрофорез.
Електрофорез білків у поліакриламідному гелі
Електрофорез білків у поліакриламідному гелі - метод розділення сумішей білків у поліакриламідному гелі відповідно до їх електрофоретичної рухливістю (функцією довжини поліпептидного ланцюжка або молекулярної маси, а також укладання білкової молекули, посттрансляційних модифікацій та інших факторів). Даний спосіб фракціонування білків і пептидів широко застосовують у сучасної молекулярної біології, біохімії, генетиці.
Розроблено велику кількість модифікацій електрофорезу білків у поліакриламідному гелі для вирішення різних завдань і для різних білків і пептидів. Найбільш поширеною різновидом є електрофорез білків в поліакриламідом гелі в присутності додецилсульфату натрію по Леммлі.
У 1970 році Леммлі для вивчення процесу складання капсида бактеріофага Т4 запропонував метод електрофоретичного розділення білків у поліакриламідному гелі в залежності від молекулярної маси. Для цього перед нанесенням на гель зразки кип'ятили у присутності додецилсульфату натрію (SDS) і 2-меркаптоетанол. Під впливом 2-меркаптоетанол відбувається відновлення дисульфідних зв'язків, що запобігає випетліваніе денатурованих поліпептидів та підвищення їх рухливості. SDS є сильним детергентом, його молекула складається з двенадцатичленная алифатической неразветвленной ланцюги і ковалентно пов'язаного з ним сульфату, що має в розчині негативний заряд.
При використанні описуваного методу виходять із наступних припущень:
- білки після обробки SDS знаходяться в повністю денатурованому стані;
- кількість молекул SDS, пов'язаних з полипептидом, пропорційно його довжині, і, отже, молекулярній масі;
- власний заряд поліпептиду неістотний в порівнянні з зарядом пов'язаного з ним SDS.
У даних умовах, все поліпептиди мають однаковий питомий заряд і розділяються обернено пропорційно логарифму їх молекулярної маси. Практика підтверджує вірність даних припущень в переважній більшості випадків.
Для проведення денатурирующего електрофорезу в ПААГ використовуються різні буферні системи. Найбільш поширена система, яка мається на увазі за замовчуванням - це буферна система Леммлі. Крім того, в переважній кількості робіт використовують, так званий, disc-електрофорез тобто використовують гель, що складається з двох частин. Концентрує гель має pH 6,8 і концент...
