нат. Витримують суміш 30 сек при кімнатній температурі і розводять фізіологічним розчином в 100 разів. Розведення вводять в лічильну камеру Горяєва і вважають кількість забарвлених і нефарбованих клітин під мікроскопом з збільшенням 100 у всій камері, кількість життєздатних клітин (X) визначають за формулою:
X = А х 200 х 1100, де
А - кількість нефарбованих клітин в камері.
Кількість нежиттєздатних (забарвлених клітин) не повинно перевищувати 3% від загального числа клітин в суспензії. p> Стадія 2. Стимуляція інтерфероногенезу - праймінг.
На цій стадії переслідують 2 основних мети; активізувати метаболізм лейкоцита (для цього в культуральне середовище вводять нативну плазму та інсулін) і стимулювати інтерфероногенезу дією інтерферону. При правильній постановці праймінг забезпечує підвищення виходу активності не менше, ніж в 4 рази.
Операція 4. Складання культурального середовища.
Лейкоцити, звільнені від домішки еритроцитів, суспендується з розрахунку 10-20 млн клітин в I мл середовища № 1, в яку додані 0,0015 од/мл інсуліну і 100-200 од/мл нативного інтерферону. Суспензію переливають у плоскодонні колби ємністю 5 л, заповнюючи тільки половину обсягу. У колбу поміщають стержень з м'якого заліза з некоррозірующім покриттям, який попередньо стерилізують автоклавуванням або прожиганием в полум'ї пальника. p> Операція 5. Суспензійне культивування.
Колби з клітинної суспензією перекривають стерильною алюмінієвою фольгою і поміщають у водяну баню з магнітно-проводить матеріалу (пластика будь-якого типу або оргскла), підключену до ультратермостат. Ультратермостат повинен забезпечувати стійке підтримки температури в клітинній суспензії в межах 37,5 В° С. Під банею завадять магнітні мішалки, обертання яких передається стрижню в культуральній колбі. При швидкості обертання 100 об/хв лейкоцити НЕ травмуються, але стійко підтримуються в суспензії.
Клітини інкубують не менше 2-х годин (біологічний час). Якщо виникає необхідність, тривалість праймінга можна збільшити до 12 - годин. Однак у цьому трапляться в культуральне середовище необхідно додати 0,005 М сукцинату натрію. p> Стадія 3. Індукція інтерферону.
Для індукції використовують бактеріологічний стерильний вірус хвороби Ньюкасла з інфекційним титром не нижче 10 8 /мл ТЦД 50 у культурі курячих фібробластів. Вірус попередньо підігрівають по 37,5 В° С.
Операція 6. Введення вірусу-интерфероногена.
Культуральні колби розкривають під полум'ям пальника і вірусосодержащую аллантоісную рідина переливають у суспензію з розрахунку 10 -100 ТЦД 50 на I лейкоцит. Так, при вмісті лейкоцитів 25 млрд. додають 250 млн вірусу з Інтерфероногенна титром 10 9 ТЦД 50 . Колбу перекривають алюмінієвою фольгою з дотриманням умов стерильності і інкубують протягом I години при 37,5 В°...
