ння необхідно застосувати фракціонування з наступним гемолізом лейкоцітсодержащей фракцій. Якщо вміст еритроцитів менше 100 клітин на I лейкоцит, обмежуються тільки гемолізом.
Операція.1. Фракціонування.
У стерильні скляні колби - відстійники грушоподібної форми з герметично закриваються верхнім і нижнім відводами, ємністю не нижче 5 л заливають 2 л стабілізуючого розчину наступного складу: апірогенна дистильована вода - I л, глюкоза фармацевтична - 20 г, аскорбінова кислота - 0,25 г, хлористий кальцій - 5 г, цитрат натрію трехзамещенний - 15 р. Стабілізуючий розчин при 20 В° С повинен мати щільність 1,05 г/мл. Розчин стерилізується автоклавуванням або фільтрацією і може зберігатися тривалий час при температурі 4 В° С. Однак, концентрований розчин цитрату натрію доцільно автоклавувати окремо і вводити безпосередньо у відстійник.
У відстійник із стабілізуючим розчином вводять рівний (2л) обсяг клітинної фракції. Суспензію ретельно перемішують і додають розчин осадителя еритроцитів у кількості 1/10 від сумарного об'єму суспензії (близько 400 мл). p> Як осадителей використовують декстран фармацевтичний з молекулярною масою не нижче 80000 Дальтон (вихідний розчин 100г/л), полівініловий спирт фармацевтичний (вихідний розчин 50 г/л або суміш 1:1 за об'ємом). Розчини осадителей стерилізують автоклавуванням або фільтрацією і можуть зберігатися тривалий час при температурі +4 В° С,
Під дію осадителей відбувається агрегація еритроцитів, що прискорює їх випадання з суспензії, В результаті відбувається розшарування суспензії на 2 фракції - темно-забарвлену нижню (фракція еритроцитів) і світлу верхню (Фракція лейкоцитів). Через нижній відвід відстійника фракцію еритроцитів зливають. Потім зливають і фракцію лейкоцитів. Клітини відокремлюють центрифугуванням. Супернатант відкидають, а осад клітин ресуспедіруют в живильному середовищі з кінцевою концентрацією 0,5% этилендиаминотетрауксусной кислоти (ЕДТА).
Операція 2. Гемоліз залишкових еритроцитів.
Для гемолізу використовують 0,83%-ний розчин хлористого амонію в апірогенної дистильованої воді, охолодженої до 4 В° С. Розчин стерилізують автоклавуванням. Клітинну суспензію заливають не менше ніж 10 обсягами гемолітико, витримують протягом 10 хв при 4 В° С, в потім клітини відокремлюють центрифугуванням (600 * Д, 10 хв, 4 В° С).
Надосадову рідину зливають і не використовують на наступних стадіях. Осад клітин суспендують у живильному середовищі 199 або мінімальної "Голка", яка містить 3 од/мл гепарину, 5% донорської плазми або сироватки, 0,1 трилону Б та 5 од/мл мономицина, середа № I.
Операція 3. Підрахунок життєздатних лейкоцитів.
Для визначення кількості життєздатних клітин використовують 1%-ний водний розчин еозінат натрію. Еозінат, фарбуються в червоний колір тільки загиблі клітини.
Відбирають 0,5 мл ретельно перемененной суспензії і об'єднують її з 0,5 мл розчину еозі...
