забарвлення. p align="justify"> б. Виявлення пероксидази (донор: Н2О2 оксидоредуктаз; КФ 1.11.1.7) в картоплі і в молоці. В основі методу лежить реакція з бензидином (див. роботу 9, а). p align="justify"> Хід визначення. У дві пробірки наливають по 1 мл відповідно сирого молока і картопляного соку. Додають в обидві проби по 5 крапель спиртового розчину бензидину і по краплі розчину пероксиду водню. Відзначають характерне фарбування. p align="justify"> Оформлення роботи. Результати занести в таблицю і відзначити характерне фарбування індикатора реакції. br/>
МатеріалВиявленний ферментСубстрат (донор) АкцепторІндікатор реакцііРезультат
У висновках вказати на присутність в біологічному матеріалі досліджуваних ферментів і практичне значення роботи.
Робота 21. Виявлення холінестерази (ацетілхолінацілгідролаза; КФ 3.1.1.7) у сироватці крові експрес-методом Херцфельда і Штумпфа
Реактиви. Смужки фільтрувального паперу, змочені субстратної-індикаторним розчином (0,2 г ацетилхоліну-броміду і 0,1 г дібромсульфофталеіна розчинити в 7 мл 96%-ного етанолу). p align="justify"> Обладнання. Предметні скла; пінцети; мікропіпеткі; годинник; водяна баня. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на зміні забарвлення індикатора дібромсульфофталеіна (від синьої до зеленого і жовтого), що відбувається в результаті звільнення оцтової кислоти при гідролізі ацетилхоліну холінестеразою:
O
? холіноестераза
(CH3) 3N +? CH2? CH2? O? C? CH3 + H2O
(CH3) 3N +? CH2? CH2OH + CH3COOH
ацетилхолін холін оцтова кислота
Хід визначення. На чисте предметне скло наносять краплю сироватки крові, на неї пінцетом опускають смужку паперу, яка тут же забарвлюється в синій колір. Засікають час. Пробу накривають другим предметним склом і відзначають час появи жовтого фарбування паперу. p align="justify"> Оформлення роботи. Занести результати (час появи жовтого забарвлення індикаторного паперу від моменту приміщення її на краплю сироватки крові) і порівняти їх з нормою, яка коливається від 5 до 20 хв. Зробити висновок про присутність досліджуваної гідролази в сироватці крові. p align="justify"> Робота 22. Визначення активності фруктозо-1 ,6-бісфосфатальдолази в сироватці крові за методом В.І. Товарницького і Е.Н. Волуйской
Реактиви. Фруктозо-1 ,6-бісфосфат, натрієва сіль, 1%-ний розчин *; суміш на альдолазой *, розчин 2,4-дінітрофенілгідразіна 0,1%-ний розчин, трихлороцтової кислота 10%-ний розчин, їдкий натрій 3% - ний розчин, калібр. розчин *.
Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки на 0,2; 0,1; 1,0; 2,0; 5,0 мл; центрифуга; термостатіруются водяна баня; фотоелектроколориметр. p align="justify"> Матеріал. Досліджувана сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на визначенні дігідроксіацетонфосфата (ДОФ), що утворюється під час розщеплення фруктозобісфосфата за участю альдолази:
В
Дігідроксіацетонфосфат при взаємодії з 2,4-дінітрофенілгідразіном утворює гідразон, який у лужному середовищі має коричнево-бурого забарвлення:
В
Хід визначення. У центрифужну пробірку (дослідна проба) до 0,2 мл суміші на альдолазой з фруктозо-1 ,6-бісфосфат (змішати 1,75 мл суміші на альдолазой з 0,25 мл фруктозо-1 ,6-бісфосфат) внести 0,1 мл сироватки крові. В іншу центрифужну пробірку (контрольна проба) взяти 0,175 мл суміші на альдолазой без фруктозо-1 ,6-бісфосфат і додати 0,1 мл сироватки крові. Обидві пробірки помістити в термостат при температурі 37? С на 1 годину. Після закінчення часу пробірки вийняти з термостата і додати до контрольної пробі 0,025 мл розчину фруктозо-1 ,6-бісфосфат. Для осадження білків в обидві пробірки внести по 0,3 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти. Центрифугувати 10 хвилин при 3000об/хв, злити центрифугат в іншу пробірку і, додавши по 0,6 мл 3% розчину їдкого натрію, залишити стояти на 10 хвилин при кімнатній температурі. Потім долити по 0,6 мл розчину 2,4-дінітрофенілгідразіна і проби помістити на 10 хвилин у термостат або водяну баню при температурі 37 Вє С, потім додати 4,2 мл 3% розчину їдкого натрію. Фотометрувати на ФЕК при довжині хвилі 530-540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі на 0,5 см проти контрольної проби. p> Примітка. Так як забарвлення нестійка, то фотометрувати слід відразу після додавання їдкого натрію. p> Розрахунок. За отриманою величиною екстинкції за калібрувальним графіком знаходять активність ферменту в мкмоль/год? Л. p align="justify"> Побудова калібрувального графіка
У ряд пробірок (див. додаток) розливають калібрувальний розчин діоксіацетона, доливають водою і далі проводять реакцію також, як і при визначенні активності ферменту.
...
