№ пробіркіКалібровочний розчин діоксіацетона, млДістіл. вода, млДіоксіацетон в пробі, мкмольФруктозо-1 ,6-біс-фосфат в пробі, мкмоль10, 050,450,50,2520,100,401,00,5030,200,302,01,040,300,203,01,550,400,104,02,0
Оформлення роботи. Після визначення активності ферменту за отриманими даними зробити висновок про можливі зміни активності ферменту і причини цих відхилень. p align="justify"> Практичне значення роботи. У нормі активність фруктозо-1 ,6-біс-фосфатальдолази становить 3,6-21,8 мкмоль/год? Л. Підвищення активності ферменту спостерігається при захворюваннях печінки, ураженні її гепатотропними отрутами, а також у разі порушень з боку серцевої і скелетної м'язів (інфаркт міокарда, прогресуюча м'язова дистрофія, міозит і т.д.). br/>
Робота 23. Визначення глюкозофосфат-ізомерази (D-глюкозо-6-фосфат Кетола-ізомераза; КФ 5.3.1.9) у сироватці крові
Реактиви. Субстратна суміш для виявлення глюкозофосфат-ізомерази *, трихлороцтової кислота, 10%-ний розчин; резорцин, 0,1%-ний розчин в 3,6%-ної соляної кислоти; соляна кислота, 36%-ний розчин. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 1 і 5 мл; водяна баня; лабораторний термометр. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на визначенні фруктозо-6-фосфату, що утворюється в ході ізомеризації глюкозо-6-фосфату під дією глюкозофосфат-ізомерази
В
Фруктозо-6-фосфат утворює з резорцином в присутності соляної кислоти сполука червоного кольору.
Хід визначення. У дві пробірки вносять по 0,5 мл сироватки крові. В одну з них (дослідну) додають 1 мл субстратної суміші і перемішують. Поміщають обидві пробірки на 30 хв у водяну баню при 37 Вє С, а по закінченні інкубації в них доливають по 1,5 мл розчину трихлороцтової кислоти (для зупинки реакції). У контрольну пробу доливають 1 мл субстратної суміші. p> Після перемішування вміст кожної пробірки фільтрують через складчастий паперовий фільтр. Відбирають по 1 мл фільтрату в чисті пробірки, доливають по 1 мл резорцину і по 3 мл розчину соляної кислоти. Суміші енергійно струшують і залишають для розвитку забарвлення. Відзначають різницю фарбування в пробах. p> Оформлення роботи. Зазначити відмінність забарвлення проб і зробити висновок про присутність ферменту в сироватці крові. br/>
3. Вивчення кінетичних властивостей ферментів
Кінетика ферментативних реакцій - це розділ ензимології, який вивчає залежність швидкості реакцій, каталізуються ферментами, від хімічної природи реагуючих речовин (тобто субстратів і ферментів) і від умов їх взаємодії, тобто від температури, концентрації компонентів, рН середовища, складу середовища, присутності модифікаторів і т.д. Вивчення кінетики ферментативних реакцій показує не тільки їх відмінності від небіологічних каталізаторів, зумовлені насамперед білкової природою ферментів, але і різноманіття умов, від яких залежить правильне визначення активності будь-якого ферменту. p align="justify"> Швидкість реакції, тобто спад субстрату або приріст кількості продукту за певні проміжки часу, є мірою каталітичної активності ферменту або просто активністю ферменту.
Використання методів якісного аналізу субстратів і продуктів реакції дозволяє виявити присутність ферменту в біологічному матеріалі, а кількісне визначення їх дає можливість визначити зміст ферменту або його активність у розрахунку на одиницю маси або обсягу досліджуваного зразка.
Робота 24. Кінетика ферментативних реакцій на прикладі ? - амілази слини
Реактиви. Крохмаль, 1%-ний розчин, свіжоприготований; розчин йоду в йодиді калію *; фосфатно-цитратний буфер, 0,1 М з рН 5,6; 6,4; 6,8; 7,2 і 8,0 *.
Обладнання. Штатив із пробірками; водяна баня; лабораторний термометр; піпетки місткістю 1 і 5 мл; бюретка місткістю 25 мл; хімічні склянки (для льоду або снігу). p align="justify"> Матеріал. Слина розбавлена ​​(див. роботу 18). p align="justify"> а. Залежність швидкості реакції від кількості ферменту. Метод заснований на визначенні швидкості гідролізу крохмалю, виявляемого пробою з йодом, в залежності від кількості доданої ? - амілази слини.
Хід визначення. Розводять вихідну розбавлену слину водою в пробірках в 20, 40, 80 і 160 разів. Беруть чотири пробірки і вносять у кожну 1 мл одного з отриманих розведень слини. У пробірки з бюретки додають по 4 мл розчину крохмалю, швидко поміщають їх у водяну баню при 38 Вє С і засікають час початку реакції. p align="justify"> Через кожні 1-2 хв відбирають по 2 краплі рідини з кожної спроби і доливають до них по 1 краплі розчину йоду в йодиді калію. Спочатку проби дають синє, потім червоно-фіолетове і, нар...
