днує першу і другу ланцюга, Нуклеази S 1 .
Для отримання необхідних ділянок РНК використовують дві групи способів: 1) розщеплення полірібонуклеотідной ланцюга РНК в заданому місці; 2) синтез РНК (ферментативний на ДНК-або РНК-матрицях і хімічний).
Розщеплення полірібонуклеотідной ланцюга РНК може здійснюватися в присутності різних ферментів. Для цієї мети використовують ферменти: рибонуклеазу H, нуклеази, ковалентно пов'язані з олігонуклеотидами (наприклад, стафілококова Нуклеази), рібозіми (наприклад, Рибозим L-19). p align="justify"> Історично першим способом спрямованої ферментативної фрагментації РНК (званої також адресованої, сайт-спрямованої або сайт-специфічної фрагментацією РНК) є розроблений в Московському університеті метод гідролізу РНК ферментом РНКази H в присутності комплементарних олігодезоксірібонуклеотідов. Цей метод до цих пір залишається найбільш універсальним способом спрямованої фрагментації РНК. p align="justify"> Метод заснований на властивості РНКази Н розщеплювати полірібонуклеотідной ланцюг РНК у складі ДНК-РНК-гетеродуплекса. До ділянки РНК, за яким планується провести її фрагментацію, синтезується комплементарний олігодезоксірібонуклеотіди довжиною в 6-10 нуклеотидних залишків. Далі отримують комплекс цього олігонуклеотиду з РНК, який потім обробляють ферментом. У роботі зазвичай використовують РНКаза Н з Escherichia coli - цілком доступний фермент, який може бути досить легко очищений від всіх супутніх нуклеазних домішок. Цей метод знайшов досить широке застосування для сайт-специфічного розщеплення вірусних і рибосомних РНК, а також для ідентифікації продуктів процесингу деяких РНК. p align="justify"> Важливим достоїнством розглянутого методу є й те, що в результаті гідролізу РНК рібонуклеазою Н утворюються фрагменти, в одного з яких на 5'-кінці міститься фосфатна група, а в іншого 3'-кінець вільний (нефосфорілірован) . Такі фрагменти можна прямо використовувати в реакції ферментативного лігування. p align="justify"> Серйозним обмеженням цього методу є те, що ділянка РНК, з яким зв'язується комплементарний йому олігодезоксірібонуклеотіди, повинен мати однотяжевую конформацію і знаходитися на поверхні макромолекули РНК, що представляє собою в умовах розщеплення компактну глобулу з розвиненою вторинної структурою. В окремих випадках це обмеження вдається подолати, використовуючи досить довгі олігодезоксірібонуклеотіди (15-20-членні), які попередньо отжигают з частково або повністю денатуруючої РНК. p align="justify"> Інше обмеження методу фрагментації полирибонуклеотидов РНКази Н у присутності комплементарних олігодезоксірібонуклеотідов полягає в тому, що в загальному випадку передбачити, яка з фосфодіефірних зв'язків у гетеродуплексе (або в безпосередній близькості від нього) піддасться розщепленню, не вдається. Більше того, фермент часто гідролізують не одну, а кілька сусідн...
