нуклеотіда та 10 од. зворотної транскриптази. Підготовлену суміш прогрівали при 65єС протягом 2 хв, потім повільно охолоджували до кімнатної температури і проводили синтез кДНК при 37єС протягом 30 хв. Далі брали по 1 мкл отриманого розчину в якості матриці для ПЛР у реальному часі з наступним режимом: 20 циклів - 32єС - 8 с., 80єС - 4 с. Час проведення реакції: синтез кДНК - 1 година, ПЛР - 40 хвилин.
Результати та обговорення
В результаті проведених модельних реакцій зворотної транскрипції і ампліфікації ми отримували ДНК-продукти розміром 32 пн, які для наочності аналізували в 10% поліакриламідному гелі (рис. 1а). На рис. 1б представлена ??крива накопичення ДНК-продукту в реальному часі залежно від кількості циклів реакції. Видно, що кількість напрацьованого продукту можна було детектувати вже з 15 циклу, і далі його накопичення збільшувалася експоненціально.
Рис. 1а Рис. 1б
Рис. 1а: Рис. 1б:
- маркер pBSK / Hpa II 1 - ампліфіката з праймерами HV1/HV3
- ампліфіката з праймерами HV1/HV3 2 - мінус-контроль
- мінус-контроль
Т. к. система флуоресцентних барвників FAM-ROX має більшу чутливість, ніж барвник SYBR Green I, то, хоча накопичення ПЛР-продукту починається дещо пізніше (рис. 2б), воно йде швидше, тому для реакції з такими праймерами досить 20-22 циклів, що значно скорочує час на проведення аналізу.
Рис. 2а Рис. 2б
- маркер pBSK / Hpa II 1 - ампліфіката з праймерами HV1F/HV3R
- ампліфіката з праймерами HV1F/HV3R 2 - ампліфіката з праймерами
- мінус-контроль HV11F/HV31R
- ампліфіката з праймерами 3 і 4 - мінус-контроль
HV11F/HV31R
- мінус-контроль
Для порівняння на рис. 3а, б наведені результати дослідів із застосуванням зворотної транскриптази. На кривій накопичення ПЛР-продукту видно, що ампліфіката кДНК, отриманого зворотного транскриптазою M-MLV фірми «Сілекс», починає детектуватиметься так само, з 14-16 циклу, але його накопичення майже в два рази повільніше, і не досягає такої кількості, як у попередніх випадках. Накопичення ампліфіката кДНК, отриманого зворотного транскриптазою AMV фірми «Promega», досягає великих значень, але починається тільки з 18-20 циклу і вимагає збільшення числа циклів реакції до 35, що значно збільшує час проведення аналізу.
Рис. 3а, б:
і 2 - ампліфіката кДНК, отриманого зворотного транскриптазою M-MLV:
- з праймерами HV1F/HV3R, 2 - з праймерами HV11F/HV31R
і 4 - ампліфіката кДНК, отриманого зворотного транскриптазою AMV:
- з праймерами HV1F/HV3R, 2 - з праймерами HV11F/HV31R
- мінус-контроль, 6 - маркер pBSK / Hpa II
Таким чином, проведені модельні експерименти показали можливість використання Tth-полімерази і методу полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі для створення швидкого та ефективного діагностичного тесту - детекції хантавірусна РНК.
Література
полімеразної ла...
