у. br/>
Робота 30. Кількісне дослідження активності препарату лактатдегідрогенази по Корнбергу
Реактиви. Фосфатний буфер, 0,1 М з рН 7,4 *; піруват натрію, розчин 2? 10-2 М на 0,1 М фосфатному буфері з рН 7,4; НАД? Н динатрієва сіль, свіжоприготований 6? 10-3 М розчин в дистильованій воді.
Обладнання. Піпетки місткістю 0,1; 1 і 5 мл; скляна паличка; секундомір; СФ або ФЕК типу КФК-2. p align="justify"> Матеріал. Розлучений продажний препарат ферменту 0,2 мкг/мл. Кристалічний препарат у вигляді суспензії в 2,2 М розчині сульфату амонію, що має активність близько 200 ФЕ/мг білка, розводять в 1000 разів 0,1 М фосфатним буфером з рН 7,4 перед досвідом (1 ФЕ відповідає 1 мкмоль перетвореного субстрату за 1 хв).
Метод заснований на безперервному вимірюванні швидкості окислення НАД? Н2, використовуваного на відновлення пірувату в реакції, що каталізується ЛДГ. Щодо зменшення екстинкції НАД? Н2 при 340 нм розраховують кількість перетвореного субстрату за одиницю часу. Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) каталізує оборотне перетворення пірувату в лактат:
Н
?
СН3 ? З ? СООН + НАД В· Н2 НАД + + СН3 ? З ? СООН
? ? p align="justify"> Про ОН
піруват лактат
Рівновага реакції зрушено вправо, тому при вивченні ЛДГ зручніше використовувати в якості субстрату піруват і НАД? Н2 і за швидкістю окислення останнього розрахувати активність цього ферменту.
Хід визначення. У кювету спектрофотометра послідовно вносять 2,4 мл фосфатного буфера, 0,2 мл розчину НАД? Н2 і 0,1 мл зразка ферменту. Перемішують скляною паличкою і ставлять у кюветодержатель. p align="justify"> Встановлюють шкалу відліку екстинкції на +0,400 і ручкою В«щілинуВ» виводять стрілку гальванометра (при відкритій шторці) на нуль. Протягом 1 хв перевіряють відсутність неферментативного окислення НАД? Н2 (в цьому випадку екстинкція не падає). p align="justify"> Додає в кювету 0,3 мл розчину пірувату натрію (запускають реакцію), швидко перемішують, ручкою В«щілинуВ» при відкритій шторці повертають стрілку гальванометра до нульової позначки і включають секундомір.
Знімають показання екстинкції (падіння її, починаючи від позначки 0,400) через кожні 30 с протягом 2-3 хв. Якщо умови реакції підібрані вірно, то за кожні 30 с спостерігається приблизно однакове зменшення екстинкції. p align="justify"> Розрахунок. Питому активність ЛДГ х (мкмоль? Хв-1? Мг-1) розраховують за формулою
? Емін3, 0? 1000
х = -------,
6,22? 0,02
де? Емін - зміна екстинкції в ході реакції за 1 хв;
, 22 - коефіцієнт екстинкції 1 мкмоль НАД? Н2 в 1 мл середовища;
, 0 - обсяг інкубаційної суміші, мл;
, 02 - кількість білка в кюветі, мкг;
- коефіцієнт перерахунку кількості білка в міліграми.
Оформлення роботи. Розрахувати питому активність ферментного препарату, молекулярну активність ЛДГ (враховуючи, що її молекулярна маса 135000). Зробити висновок про якість досліджуваного препарату (схоронність вихідної активності,%). p align="justify"> Практичне значення роботи. Принципи виміру активності лактатдегідрогенази спектрофотометричним методом безперервного спостереження використовуються при дослідженні інших ферментних препаратів, очищених ферментів і в клініко-біохімічних лабораторіях при кількісному визначенні активності ферментів в біологічних рідинах і біоптату в нормі і при патології. br/>
Робота 31. Фотоколориметричний метод дослідження активності лактатдегідрогенази в сироватці крові по Севели і Товареку
Реактиви. Лактат натрію, 0,45 М розчин або нейтралізована гідроксидом натрію молочна кислота тій же концентрації; пірофосфат натрію, 0,03 М розчин (Na4P2O7? 10H2O розчинити в 50 мл води, довести рН до 8,8 за допомогою 1 М соляної кислоти і долити водою до 500 мл); НАД, свіжоприготований розчин 3мг/мл; 2,4-дінітрофенілгідразін, 0,2%-ний розчин в 1 М розчині соляної кислоти; гідроксид натрію, 0,4 М розчин; піруват натрію, розчин для побудови калібрувального графіка (містить 11 мкг пірувату натрію або 8,8 мкг піровиноградної кислоти в 1 мл).
Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1; 1 і 5 мл; ФЕК; водяна баня з лабораторним термометром. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на визначенні швидкості утв...
