орення пірувату в ході окислення лактату за участю лактатдегідрогенази сироватки крові:
В
СН3 ? СН ? СООН + НАД + СН3 ? З ? СООН + НАД В· Н2
? ? p align="justify"> ОН Про
лактат піруват
Піруват з 2,4-дінітрофенілгідразіном утворює відповідний гідразон, що має червоно-буре фарбування в лужному середовищі, інтенсивність якого прямо пропорційна вмісту кетокислоти:
В
Хід визначення. Сироватку крові розводять у 3 рази дистильованою водою. Вносять в пробірку 0,1 мл розведеної сироватки, 0,3 мл розчину НАД + і ставлять на 5 хв у водяну баню при 37? С (для прогрівання суміші). p> У другу пробірку додають 0,8 мл розчину пірофосфату натрію і 0,2 мл розчину лактату натрію і нагрівають на водяній бані при 37? С.
Виливають вміст другої пробірки в першу, швидко перемішують скляною паличкою, не виймаючи пробірки з лазні, і відзначають час початку інкубації. Через 25 хв реакцію зупиняють, додаючи 0,5 мл розчину 2,4-ДНФГ, й залишають пробірку на 20 хв при кімнатній температурі (для утворення гідразону). p> До суміші доливають 5 мл розчину гідроксиду натрію, вміст перемішують скляною паличкою і через 10 хв (після розвитку забарвлення) вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної на ФЕК при довжині хвилі 520-560 нм (світлофільтр зелений) в кюветі з товщиною шару 1 см.
Контрольну пробу готують як дослідну, але розведену сироватку додають після інкубації.
Розрахунок. Активність ферменту розраховують за калібрувальним графіком, умови побудови якого наведені в таблиці. br/>
№ пробиПіруват натрію, млПірофосфат натрію, млДістіллірованная вода, млСодержаніе пірувату в пробі, мкмольЕдініци активності ЛДГ,
По осі ординат відкладають значення екстинкції, а по осі абсцис - відповідні їм одиниці активності ЛДГ, виражені в ммоль/(год? л).
Оформлення роботи. Розрахувати активність ферменту в досліджуваній сироватці крові, зробити висновок про можливу зміну активності і його причини. p align="justify"> Практичне значення роботи. Визначення активності лактатдегідрогенази використовується в клініко-біохімічних лабораторіях для діагностики та встановлення прогнозу захворювання. У нормі активність ферменту становить 0,8-4,0 ммоль/(год? Л) і зростає, як правило, у хворих з пошкодженням міокарда, скелетних м'язів, нирок, а також при анеміях, пухлинних ураженнях, гострому гепатиті і т.д .
Робота 32. Визначення активності лужної фосфатази в сироватці крові по Боданський
Фосфатази - ферменти, отщепляющие фосфат від різних субстратів. Серед них є ензими з неоднаковою специфічністю по відношенню до субстратів. Лужна фосфатаза діє в лужному середовищі (чим відрізняється від фосфатаз, які здійснюють каталіз в нейтральній або кислої середовищах) і є малоспецифичними. p align="justify"> Реактиви. ? - Гліцерофосфат, лужної розчин на медіналовом буфері з рН 8,6 *; трихлороцтової кислота, 10%-ний розчин; реактив молібдату амонію *; аскорбінова кислота, 1%-ний розчин на 0,1 М розчині соляної кислоти; дигідрофосфат калію (наважку 0,4394 г KH2PO4, попередньо висушеної в ексикаторі над сірчаною кислотою, зважують на аналітичних вагах і розчиняють в колбі місткістю 100 мл; потім цей розчин розводять у 100 разів і використовують для побудови калібрувальної кривої).
Обладнання. Штатив із пробірками; центрифуга лабораторна з Центрифужна вагами; піпетки місткістю 0,2; 1 і 5 мл; водяна баня з лабораторним термометром; ФЕК. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на фотоколориметричні визначенні неорганічного фосфору, відщеплюється від ? - гліцерофосфату під дією фосфатази сироватки крові в лужної среде:
СН2ОН СН2ОН
? Фосфатаза? p align="justify"> НС ? Про ? РО3Н2 + Н2О НС ? ОН + Н3РО4
? рН 8,6?
СН2ОН СН2ОН
? - гліцерофосфат гліцерин
Неорганічний фосфат визначають з освіти фосфомолібдата амонію з подальшим відновленням його в молибденовую синь аскорбінової кислотою (див. роботу 11).
Хід визначення. У дві пробірки вносять по 1 мл розчину ...
