що входить в активний центр, пригнічуючи тим самим каталітичну активність цих ферментів. Завдяки цьому азиди і ціаніди є сильними отрутами. Враховуючи, що вони неконкурентні інгібітори, зняти їх дію можна тільки тими речовинами, які пов'язують їх і звільняють з активного центру фермента. br/>
6. Кількісне визначення активності ферментів
У клініко-біохімічних лабораторіях широко використовується кількісне визначення активності ферментів для діагностики захворювань, а також для контролю за проведеним лікуванням. У фармації воно необхідне для контролю якості ферментних препаратів, а в наукових біохімічних дослідженнях - для спостереження за процедурою очищення ферменту. p align="justify"> Про активність ферменту судять за кількістю перетвореного субстрату або утворився продукту реакції за певний проміжок часу. Швидкість ферментативної реакції графічно описується у вигляді гіперболи - крива Міхаеліса-Ментен, тому для правильного вимірювання активності ферментів необхідно дотримуватися ряду правил. Визначення слід вести в стандартних умовах, тобто при насичуючих концентраціях субстрату або субстратів, оптимумі рН середовища та постійній температурі, що повинні підтримуватися весь період спостереження. При вивченні складних ферментів в середу додають необхідні кофактори. Ці умови забезпечують нульовий порядок реакції, при якій її швидкість лімітується тільки концентрацією досліджуваного ферменту. Вимірювати активність ферменту потрібно не за будь-який відрізок часу, а тільки за початковий, коли швидкість реакції протікає лінійно, тобто за единицу часу перетворюється одне і те ж кількість субстрату (це так звана початкова швидкість реакції).
Залежно від способу реєстрації всі методи визначення ферментативної активності можна поділити на два типи: метод відбору проб і безперервного спостереження. У першому випадку перед інкубацією і через певні відрізки часу в ході реакції відбирають проби розчину, осаджують білок і визначають у безбілкової рідини зміст субстратів або продуктів реакції. За отриманими даними будують криву залежності утворення продуктів реакції від часу і розраховують активність ферменту. У другому випадку спостереження ведуть безперервно або автоматично реєструють хід реакції, якщо субстрат (або продукт реакції) поглинає в певній області спектра або флуоресціює, що дозволяє постійно стежити за зміною його концентрації в середовищі за обрані проміжки часу. p align="justify"> Метод безперервної реєстрації дуже чутливий, зручний і економічний, так як для нього потрібні невеликі кількості біологічного матеріалу або ферментного препарату. Він широко використовується при кількісному вимірі активності окислювальних ферментів, для дії яких необхідні нікотинамідні коферменти. Окислені форми їх (НАД + і НАДФ +) не поглинають при 340 нм, а відновлені (НАД? Н2 і НАДФ? Н2) мають максимум абсорбції при цій довжині хвилі. Тому швидкість ферментативної реакції визначають за ступенем відновлення окислених форм даних коферментів або за ступенем окислення відновлених форм. p align="justify"> Для вираження активності таких ферментів використовують молярний коефіцієнт екстинкції відновлених форм НАД і НАДФ, який при 340 нм дорівнює 6,22? 106 см2/моль, або 6,22? 103л? моль-1? см- 1. Це означає, що якщо в процесі реакції відбулася зміна екстинкції на 6,22? 106, то це вказує на освіту (або спад) 1 благаючи відновленого коферменту в розрахунку на 1 мл реакційної суміші. Якщо екстинкція змінюється на 6,22? 103 або на 6,22, то відповідно утворюється (або витрачається) у ході реакції 1 ммоль або 1 мкмоль відновлених коферментів на 1 мл середовища. Можна також спостерігати за швидкістю ферментативної реакції з поглинання відновленого НАД і НАДФ при 366 нм. Молярний коефіцієнт екстинкції в цьому випадку дорівнює 3,3? 106 см2/моль. p align="justify"> Концентрацію досліджуваного ферменту підбирають таким чином, щоб забезпечити зміну екстинкції на 0,010-0,100 за 1 хв. Якщо цей показник вищий, то проба, що містить фермент, розлучається, якщо нижче, то береться більший обсяг досліджуваного зразка. p align="justify"> Для безперервного спостереження за ходом реакції по светопоглощению відновлених форм НАД (НАДФ) або інших субстратів при певній довжині хвилі потрібні спектрофотометри. Однак, сучасний фотоелектроколориметр типу КФК-2 дозволяє проводити вимірювання ферментативної активності, наприклад, при 366 нм (розрахунок проводиться за екстинкції розчину НАД? Н або НАДФ? Н з відомою концентрацією). p align="justify"> При неможливості спостерігати за реакцією безперервно активність ферменту вимірюють методом відбору проб, причому зміст субстратів і продуктів реакції визначають різними способами. Найбільш поширені колориметрические методи. p align="justify"> Правила вираження активності ферментів в одиницях СІ були викладені раніше (див. с.11). Температура, при якій проводиться визначення, вказується при вираженні активності фермент...
