чину сахарози. Потім готують Полімеризується суміш, що складається з розчинів № 1, № 2, персульфата амонію і дистильованої води в співвідношенні 1:2:4:1. Суміші готують з розрахунку 2 мл на одну трубочку. p align="justify"> Приготовану Полімеризується суміш розливають у скляні трубочки, використовуючи по 2 мл на кожну. Потім на поверхню цього розчину обережно нашаровуються 0,2-0,3 мл дистильованої води піпеткою з тонким витягнутим кінцем (це покращує полімеризацію гелю в трубочках, яка протікає без доступу кисню повітря, і формує гладку поверхню гелю). Через 30 хв зазвичай полімеризація завершується, про що свідчить ясно помітна межа між поліакриламідних гелем і водою. Після цього перевертають трубочки і обережно струшують з гелю нашарувань воду, а залишки води видаляють з трубочки за допомогою фільтрувального паперу. p align="justify"> Скляні трубочки з заполімерізованним гелем закріплюють у гніздах верхньої камери для електрофорезу. На поверхню гелю в трубочці наносять спочатку 0.1 мл сироватки крові, потім такий же об'єм розчину сахарози і перемішують нанесені рідини скляною паличкою. Обережно нашаровуються на цю рідину розведений у 10 разів електродний буфер, заповнюючи їм простір до верхнього краю трубочки. p align="justify"> Нижню камеру апарату заливають тим же електродним буфером, встановлюють верхню камеру над нижньою так, щоб нижні кінці трубочок були занурені в електродний буфер. Потім верхню камеру теж заповнюють електродним буфером. p align="justify"> Апарат для електрофорезу ставлять у холодильник. Електроди підключають до джерела постійної напруги: нижній електрод до анода, верхній до катода (див. рис. 3). Протягом перших 10 хв електрофорез проводять при силі струму 2 мА на кожну трубочку. Потім силу струму збільшують до 4 мА. Тривалість електрофорезу близько 90 хв. p align="justify"> Поки йде електрофорез, для виявлення ізоферментів ЛДГ готують в колбі инкубационную суміш наступного складу: розчини лактату натрію, хлориду магнію, НАД - по 1 мл, фосфатного буфера і НС - по 2,5 мл і ФМС- 0,25 мл. Перемішують вміст колбочки. p align="justify"> Після закінчення електрофорезу гелі витягують з трубочок. Для цього використовують шприц на 10-20 мл з тонкою довгою голкою. Вводять голку між стінкою трубочки і гелем. Круговими рухами отслаивают гель, постійно видавлюючи воду зі шприца і просуваючи голку до протилежного кінця трубки. При цьому стовпчик гелю легко вискакує з трубки. p align="justify"> Стовпчик гелю поміщають в пробірки діаметром 7-8 мм і наливають у них инкубационную суміш так, щоб весь стовпчик гелю був занурений у проявляючу рідина. Пробірки ставлять у термостат при 37? С на 40-60 хв. Ізоферменти ЛДГ виявляються у вигляді синьо-фіолетових кілець на стовпчику гелю. p align="justify"> Після закінчення інкубації стовпчики гелю промивають водою, переносять в пробірки, що містять розчин оцтової кислоти, і зберігають у темряві.
Кількісну обробку гелевих ізоензімограмм проводять спектрофотометричним методом або за допомогою денситометрії. У першому випадку лезом вирізають забарвлені ділянки гелю, поміщають їх у пробірки і заливають 1 мл підігрітого до +80-85? З розчину диметилформаміду. Потім забарвлену рідину зливають в мікрокювет і вимірюють екстинкцію на спектрофотометрі або ФЕК при 540 нм проти розчину диметилформаміду. p align="justify"> Другий спосіб обробки полягає в скануванні гелів на мікроденсітометре. Денсітограмми піддаються кількісній обробці. p align="justify"> Розрахунок. Відносну активність кожного ізоферменту х (%) висловлюють у відсотках від суми екстинкції всіх ізоферментів ЛДГ:
ЕА100% Е100
х = ------, або, спрощено, х = ---,
? Е? Е
де Е - екстинкція елюата ізоферменту з зони гелю, що відноситься до даного ізоферменту;
? Е - сума екстинкції всіх ізоферментів;
А - активність ЛДГ сироватки крові, ммоль/(год В· л).
Оформлення роботи. Замалювати отриману ізоензімограмму і розрахувати відносну активність ізоферментів ЛДГ (у%). Зробити висновок про зрушення спектра ізоферментів ЛДГ в досліджуваній сироватці і вказати на ймовірні причини цього явища. p align="justify"> Практичне значення роботи. Склад ізоферментів ЛДГ має внутрішньоклітинну, тканинну і видову специфічність. Тканинні відмінності ізоферментного спектру ЛДГ з'явилися передумовою для використання його у діагностиці та прогнозі ряду захворювань, що супроводжуються некрозом органів і тканин. Відомо, що в серцевому м'язі, нервової тканини, нирках висока активність ЛДГ1 і ЛДГ2 (ізоферменти Н-типу), в підшлунковій залозі і легеневої тканини переважає ЛДГ3, а в скелетної м'язі і печінки - ЛДГ4 і ЛДГ5 (ізоферменти М-типу). При некрозі цих тканин знаходяться в них ізоферменти надходять у кров і змінюють її нормальний спектр. У нормі сироватка крові має приблизно такі співв...
