? - гліцерофосфату і поміщають на 5 хв у водяну баню при 37? С. Потім в дослідну пробірку додають 0,2 мл сироватки крові, перемішують і відзначають час початку інкубації у водяній бані.
Через 1 годину доливають в обидві пробірки по 1,8 мл розчину трихлороцтової кислоти, а в контрольну - ще 0,2 мл сироватки крові. Перемішують проби, залишають стояти 5 хв для осадження білка. Центрифугують вміст обох проб протягом 5 хв при 3000 об/хв. p align="justify"> Відбирають в чисті пробірки по 1,5 мл надосадової рідини (для визначення в ній неорганічної фосфату Фн) і доливають по 1 мл реактиву молібдату амонію і по 1 мл розчину аскорбінової кислоти. Через 10 хв вимірюють екстинкцію дослідної та контрольної проб на ФЕК, при довжині хвилі 630-690 нм (червоний світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 0,5 см проти розчину реактивів (1,5 мл розчину трихлороцтової кислоти і 1,5 мл дистильованої води ).
Розрахунок. Активність ферменту розраховують за калібрувальним графіком, умови побудови якого наведені в таблиці. br/>
№ пробиРаствор KH2PO4, млН2О, млТріхлоруксусн. кислота, млМолібдат амонію, млАскорбіновая кислота, млФн в пробі, мгАктівность ферменту,
По осі ординат відкладають значення екстинкції, а по осі абсцис - відповідні одиниці лужної фосфатази, виражені в ммоль/(год? л).
Оформлення роботи. За отриманими значеннями екстинкції знайти активність ферменту. На підставі цього зробити висновок про можливість зміни активності в досліджуваній сироватці і вказати на передбачувані причини. p align="justify"> Практичне значення роботи. У клініці використовується визначення активності лужної фосфатази в сироватці крові в основному у хворих з ураженнями кісткової тканини і печінки, особливо з явищами затримки відтоку жовчі. У нормі активність ферменту становить 0,5-1,3 ммоль/(год? Л). Підвищення активності в сироватці крові спостерігається при рахіті (гіповітамінозі D), пухлинах кісткової тканини, гиперпаратиреозе, механічної жовтяниці, вірусному гепатиті і т.д., а зниження - при гіпотиреозі, гіповітамінозі С та ін
7. Дослідження ізоферментів
Ізоферменти відрізняються один від одного кількома фізико-хімічними ознаками і, зокрема, зарядом молекул, тому електрофорез здавна використовується для їх розділення. Ізоферменти лактатдегідрогенази були відкриті одними з перших. p align="justify"> Розрізняють п'ять типів ізоферментів ЛДГ, які в порядку рухливості до анода позначаються: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 і ЛДГ5. p align="justify"> Кожен з них являє собою тетрамер, що відрізняється складом субодиниць (див. підручник, с.226, 438).
Робота 33. Поділ ізоферментів лактатдегідрогенази сироватки крові методом електрофорезу в поліакриламідному гелі за Дітце і Лубрано
Використання як середовища гелю поліакриламіду дозволяє домогтися високого дозволу при електрофорезі білків і ферментів, оскільки цей гель грає роль молекулярного сита, що забезпечує додатковий поділ частинок за молекулярною масою.
Реактиви. Розчин № 1 для полімеризації гелю з рН 8,9 (1,0 М соляна кислота - 48 мл, трис-підстава - 36,6 г, N, N, N, N-тетраметілетілендіамін, або ТЕМЕД - 0,23 мл і дистильована вода до 100 мл); розчин № 2 (акриламід - 30,0 г, N, N-метіленбісакріламід - 0,8 г і дистильована вода до 100 мл); персульфат амонію, 0,14%-ний свіжоприготований розчин, сахароза, 40 %-ний розчин; електродний буфер з рН 8,9 (трис-підстава - 6,0 г, гліцин - 28,8 г, дистильована вода до 1 л; перед вживанням розводять у 10 разів); оцтова кислота, 7%-ний розчин; фосфатний буфер, 0,5 М з рН 7,4; лактат натрію, 1 М розчин; НАД, 10 г/л розчин; нітротетразоліевий синій (НС), 1 г/л розчин; феназінметасульфат (ФМС), 1 г/ л розчин; хлорид магнію, 0,005 М розчин; хлорид натрію, 0,1 М розчин.
Обладнання. Колба конічна місткістю 25 мл; піпетки з витягнутим тонким кінцем; фільтрувальний папір; скляні палички; штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1; 1,5 і 10 мл; гумові ковпачки; апарат для електрофорезу зі скляними трубочками; джерело постійної напруги; мікроденсітометр ; спектрофотометр або ФЕК.
Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на різній електрофоретичної рухливості ізоферментів ЛДГ, положення яких на стовпчиках поліакріламідного гелю виявляється за допомогою речовин, що переносять водень від лактату через феназінметасульфат на нітротетразоліевий синій. У результаті в місці знаходження фракції ЛДГ випадає фіолетово-синій осад діформазана. p align="justify"> Хід визначення. Для полімеризації гелю беруть сухі чисті скляні трубочки, закривають їх з одного кінця гумовими ковпачками, встановлюють у штативі строго перпендикулярно і вносять до них краплю роз...
