н, генотип яких можна змінити аналогічно мікроорганізмам, ціле рослина з новими ознаками. Завдання залишилася за пошуком відповідного вектора для перенесення потрібного гена у виділені камбіальні клітини. [3]
Дослідникам допомогла сама природа. Ще древнім грекам було відомо явище, зване корончата галлами. В уражених рослинах клітини корончата галлів набувають здатність необмежено розмножуватися, залишаючись недиференційованими. Такі клітини за своїми властивостями дуже схожі на ракові клітини тварин. Але тільки в XX столітті вченим вдалося встановити і вивчити причину виникнення такого явища. Винуватицею виявилася одна з грунтових бактерій -Agrobacterium tumefaciens. Така бактерія, як і багато інших, містить плазміди. Одна з них, названа Ti-плазміда (від англійського скорочення пухлина індукують ), і виявилася опухолеродним агентом для клітин зараженого растенія.плазміда складається з декількох функціонально різних ділянок ДНК. Найбільш важливу роль відіграє ділянку Т-ДНК, який переноситься в клітину зараженого рослини і вбудовується в її хромосому. Там знаходяться гени синтезу фітогормонів і опинилися. Фітогормони ауксин і цітікінін пригнічують диференціювання пухлинних рослинних клітин і переводять їх у стан поділу, а опінія використовуються бактерією як джерело вуглецю, азоту та енергії. Іншими учас?? ками ДНК в Ti-плазміди є tra-область, де локалізовано гени, які контролюють кон'югацію бактерій, і ori-область, продукти якої забезпечують розмноження плазміди в бактеріальної клітці. Ще один важливий локус ДНК називається vir-область. Там містяться гени, відповідальні за перенесення Т-ДНК в рослинну клітину і вбудовування її в хромосому. [Додаток 2, рис.1]
Найчастіше для створення трансгенних рослин використовують наступний підхід. Сегмент Т-ДНК вирізують з Ti-плазміди за допомогою рестриктаз і вбудовують в стандартну плазмиду-вектор бактерії Escherichia coli. Рекомбінантна плазмида розмножується, і в ділянку Т-ДНК вставляють потрібний ген так само, як і в звичайну плазміду, з використанням рестриктаз. Такий молекулярний гібрид вводять в Agrobacterium tumefaciens, що містить незмінену Ti-плазміду. Завдяки процесу рекомбінації відбувається обмін гомологічними ділянками ДНК рекомбінантної і Ti-плазмід. В результаті вийде рекомбінантна Ti-плазміда, несуча потрібний ген. Роблять невелике ушкодження в рослинної тканини, виділяється сік з кислою реакцією і високою концентрацією лігніну. Це специфічно стимулює експресію генів vir-області. Лігнін взаємодіє з продуктом гена virA, передається сигнал всередину клітини, активується продукт гена virG, що в свою чергу активує інші гени вірулентності. Білок VirD2 в комплексі з білками VirC1 і VirD1 вносить одноцепочечниє розриви в нуклеотидні послідовності правої і лівої кордонів Т-ДНК. Синтезується нова ланцюг Т-ДНК, а стара, з приєднаним до 5-кінців VirD2, витісняється. Процес повторюється, і в клітині накопичується одноцепочечная Т-ДНК, готова до перенесення. Потім комплекс Т-ДНК з білками VirD2 і VirE2 направлено переноситься в клітину рослини за допомогою процесу, подібного з бактеріальною кон'югацією. Перенесення відбувається через пили, а потім через канал в клітинній мембрані рослини, сформований білком VirE2. VirD2 і VirE2 сприяють проникненню Т-ДНК в геном рослини. [Додаток 2, рис.2] Сайти інсерції випадкові. Процес триває близько 30 хвилин. Поодинокі рослинні клітини заражаються, вирощується цілу рослину, всі клітини якого будуть експресувати потрібний ген. [Додаток 3, рис.1] [5]
Іноді виявляється простіше використовувати відразу дві рекомбінантні плазміди. Одна з них містить тільки vir-область і є плазмидой-помічницею. Друга плазмида повинна містити Т-ДНК з вбудованим потрібним геном. Плазміда-помічниця здатна переносити в рослинну хромосому не тільки свою Т-ДНК, якої у неї і немає, але і сусідню. Для полегшення відбору отриманих ГМ-рослин, рекомбінантна Ti-плазміда несе спеціальний маркерний ген. На відміну від мікроорганізмів, де в якості маркера використовується стійкість до антибіотиків, у рослинах використовують особливі білки, що володіють здатністю світитися в ультрафіолетовому світлі. Найбільш часто використовують гени люціферази світлячків і ген GFP медузи (по-англійськи, зелений світиться білок ).
Крім технології, заснованої на використанні Ti-плазміди, останнім часом застосовуються і інші способи перенесення рекомбінантних ДНК в рослини. Сучасний арсенал методів трансформації дуже великий і включає такі підходи, як електропорація клітин (пропускання електричного розряду через суміш досвідчених клітин і рекомбінантних плазмід, при цьому в мембранах клітин виникають проломи, і ДНК проникає в клітину і вбудовується в геном), струшування суміші клітин, ДНК і мікроголок (які проколюють мембрани аналогічно електричному току), опосередкована вірусами інфекція, мікроін'єкції ДНК в клітини. Промислове застосува...
