в бактерію, яка здатна рости в простих умовах і надзвичайно швидко розмножуватися. Але спроби провести перенесення в бактерії безпосередньо геномної ДНК привели до суперечливих результатів. Тільки в 70-і роки були отримані відтворювані результати із застосуванням так званої векторної трансформації. В основі цього підходу лежить використання векторних молекул - ДНК, здатних переносити містяться в них гени в клітку, де ці молекули реплицируются автономно або після інтеграції з геномом. Вирішальну роль у цих експериментах зіграли також методи отримання індивідуальних генів, напрацювання їх у необхідній кількості шляхом клонування, тобто практично необмеженого розмноження в бактеріальних клітинах. [3]
В основі всіх досягнень генетичної інженерії лежить одна з особливостей будови геному бактерій - наявність у них невеликих, відмінних від хромосоми, кільцевих молекул ДНК, що називаються плазмідами. Плазміди широко поширені в природі і зустрічаються у переважної кількості прокаріотів, а також у нижчих еукаріот - дріжджів. Важливою властивістю плазмід є їх здатність реплицироваться (розмножуватися) разом з ДНК клітини хазяїна. Клітини господаря не потребують плазмидах для виживання в звичайних умовах, але часто плазміди надають їм ряд особливих властивостей. Плазміди надають бактеріям здатність до статевого розмноження (F-фактор), стійкість до антибіотиків і дезінфікуючих засобів (R-фактор), можливості засвоєння деяких складних органічних речовин, наприклад, вуглеводнів. Основна маса досліджень, які призвели до розвитку генної інженерії, проводилася на класичному об'єкті мікробіологів - кишкової паличці Escherichia coli. За допомогою спеціальних ферментів - ендонуклеаз рестрикції, або рестриктаз, плазміда, несуча який-небудь маркерний ген, наприклад, ген стійкості до певного антибіотику, розрізається в строго визначеному місці з утворенням з кожного боку декількох (від одного до п'яти) неспарених підстав - липких кінців raquo ;. За допомогою таких же рестриктаз виходить фрагмент генома організму-донора, що несе потрібний ген, наприклад, ген людського інсуліну. Останнім часом Донорний ДНК частіше отримують шляхом пришивання липких кінців до молекули ДНК, отриманої шляхом зворотної транскрипції з матричної РНК потрібного гена (кДНК). Головну роль тут відіграє фермент зворотна транскриптаза, або ревертаза, вперше відкрита у ретровірусів (таких як ВІЛ і деякі збудники злоякісних новоутворень - онковирусов). Далі за рахунок комплиментарного взаємодії неспарених підстав липких кінців відбувається включення потрібного гена в плазміду, при цьому утворюється нова рекомбінантна (гібридна) ДНК. Завершує процес фермент ДНК-лігаза, яка ковалентно зашиває розриви в ланцюгах ДНК. Наступний етап - перенесення рекомбінантної плазміди в бактерію. Такий процес - включення чужорідної ДНК в бактеріальну клітину носить назву трансформації, а молекула ДНК - вектор. [Додаток 1, рис.1] Це явище зустрічається в природі, що говорить про те, що трансформація - це природний біологічний процес. У природних умовах трансформація зустрічається у таких бактерій, як збудник пневмонії.
Значно складніше піддати генетичної модифікації еукаріотичні мікроорганізми, а саме гриби. Як і у бактерій, у них є плазміди, але використання їх як векторів часто виявляється не дуже ефективно. Тому для того, щоб виник стабільний трансформант, необхідні дві послідовних події: проникнення рекомбінантної ДНК у клітину та її інтеграція у хромосомну ДНК. Такий метод називається інтегративної трансформацією. Надалі генно-інженерне конструювання у дріжджів пішло по шляху створення кільцевих плазмід з центромерами, особливими ділянками ДНК, що забезпечують зв'язок з білками веретена поділу і, отже, рівномірний розподіл таких плазмід між двома клітинами під час мітозу. Розвиток цього підходу призвело до створення цілих штучних міні-хромосом, що містять, крім центромерного ділянки, теломери на кінцях, загнуті у вигляді шпильки, і реплікатори - ділянки початку реплікації ДНК. Подібні мініхромосоми можуть включати відразу кілька корисних генів, що забезпечує виробництво потрібної біотехнологічної продукції.
. 2.2 Отримання трансгенних рослин
Вся робота з трансгенними рослинами спрямована на докорінну зміну методів традиційної селекції - бажані ознаки виходять завдяки введенню потрібних генів безпосередньо в рослину замість тривалої роботи по схрещуванню різних ліній. Складність такого підходу полягає в тому, що на відміну від бактерій і дріжджів, рослини є багатоклітинними організмами. Для отримання продукту потрібний ген повинен знаходитися в кожній клітині організму, що досить складно здійснити. Але у рослин можлива повна регенерація in vitro з недиференційованих соматичних тканин з отриманням нормальних, здатних давати насіння, рослин. Ця властивість, зване тотипотентностью, дає унікальну можливість отримати з одиничних кліти...
