y"> 0 суміші, що з 10 мл 0,15 М розчину хлористого натрію, 3 мл карбонат-бікарбонатного буфера, рН 9,0, і 2 мл ацетону, додають 10 мл розведеного глобуліну, кількість білка в якому відомо. При помішуванні в суміш вносять по краплях 1,5 мл ацетону з розчиненим у ньому ізотіоцианатом. На кожні 100 мг білка додають по 5 мг барвника. Приготовану реакційну суміш залишають у холоді при 4 0 для перемішування на магнітній мішалці на 16-20 годин.
Метод Маршала. Глобулін розводять 0,15 М розчином хлористого натрію і 0,5 М карбонат-бікарбонатним буфером, рН 9,0, так щоб в 1 мл було 10 мг білка і 10% буфера. Барвник вносять в суміш у вигляді порошку з розрахунку 5 мг на 100 мг білка. p align="justify"> У процесі кон'югації не весь барвник вступає в міцну хімічний зв'язок з білком, в результаті чого з сироватки необхідно видалити незв'язаний або неміцно пов'язаний флуорохром (діалізом або колонкової хромотограф).
Діаліз ведуть в целофанових мішечках або гільзах проти 0,15 М розчину хлористого натрію в 0,01 М фосфатному буфері, рН 7,2-7,4, при температурі 4 0 протягом 5-7 днів, періодично міняючи діалізаційні рідина. Діаліз припиняють коли в зовнішній діалізаційні рідини буде відсутній барвник. Щоб у цьому переконатися, необхідно пробу рідини періодично досліджувати в ультрафіолетових променях на відсутність флуоресценції. Скоротити час діалізу можна, попередньо переосадів мічені глобуліни п'ятикратними обсягами ацетону, охолодженого до -15, -17 0 , і відокремлюючи опади центрифугуванням . Після видалення надосадової рідини осад розчиняють в 0,15 М розчині хлористого натрію, рН 7,2-7,4. Замість обробки ацетоном можна використовувати насичений розчин сірчанокислого амонію. Вельми ефективний метод видалення барвника, не пов'язаного глобуліном - колоночнаяхромотографія з використанням сефадексе Г-50 і діетіламіноетіл целюлози.
Послідовність колонкової хроматографії: сефадексе тричі відмивають 0,01 М фосфатним буфером, рН 7,5, для видалення дрібних частинок. Приготовану суспензію вливають у колонку і дають їй осісти. Потім, випустивши надлишок буферного розчину, вносять неочищений кон'югат глобуліну і при повільному струмі елююють 0,01 М буферним розчином. p align="justify"> Для більш повного звільнення мічених глобулінів від незв'язаного барвника проводять хромотограф на колонці з ДЕАЕ-целюлозою. У цьому випадку здійснюють градіентнуюелюцію 0,01 М фосфатним буфером при концентрації хлористого натру, зростаючою від 0 до 0,2 М.
раз споряджені обмінні колонки можна використовувати багато разів, але після кожного досвіду їх потрібно регенерувати.
Для підвищення специфічност...
