з білком в різної концентрації і фільтруються через нітроцелюлозні фільтри. У ідеалі при високій концентрації білка має утримуватися до 100% РНК, в Насправді ж цей відсоток значно менше. Крім того, білкові фракції також можуть не утримуються фільтром. Наприклад, при аналізі взаємодії білка L18 з 5S рРНК було виявлено, що ефективність зв'язування комплексу 5SрРНК-L18 становила 35% при утриманні 65% білка L18, і <5% для вільної 5S рРНК. Проте, точність вимірювання не залежить безпосередньо від ефективності затримування. p> На оцінку ефективності зв'язування впливають багато параметри, і вони повинні бути оптимізовані для кожного конкретного випадку:
Буфер : Підвищення концентрації солей зменшує ефективність зв'язування. Для більшості комплексів концентрація одновалентних іонів повинна становити близько 150 mM, щоб гарантувати специфічність зв'язуватися.
Температура : Низька температура збільшує ефективність зв'язування.
Швидкість подачі буфера і умови промивки : швидкість подачі буфера повинна бути постійною (однієї і тієї ж) у кожному експерименті. Неспецифічне утримання незв'язаного РНК на фільтрі можна зменшувати інтенсивної промиванням, але найчастіше це веде і до зниження специфічної сорбції в цілому. Тому для деяких комплексів застосовується промивка невеликим обсягом, у той час як для інших комплексів найкращі результати виходять при промиванні великими обсягами.
ренатурація РНК : добре відомо, що різні препарати РНК дають різну ефективність зв'язування. Ретельна ренатурація зменшує варіабельність між цими препаратами [23]. br/>
1.3.1.2. Рухливість в гелі
Оцінка рухливості в гелі заснована на різниці в рухливості між вільними РНК і РНК-білковими комплексами при їх міграції в нативної поліакриламідному гелі. Зростаючий розмір комплексу, а також невеликий позитивний заряд пов'язаних з білками нуклеїнових кислот викликає розходження в їх рухливості.
Метод дозволяє безпосередньо оцінити стехіометрію РНК-білкового комплексу. Якщо зв'язується більш ніж один білок, то видно додаткові зрушення (supershifts) в мобільності РНК. При додавання антитіл, цю особливість можна використовувати для ідентифікації білків в комплексі, коли для освіти комплексу використовуються невідомі препарати білка. p> Основна проблема виконання даної методики - це вибір умов, що забезпечують специфічне РНК-білкове зв'язування. Головне при цьому - витримати високу концентрацію солей (300-500 mM NaCI або KC1), але при цьому треба враховувати, що висока концентрація солі часто збільшує і відсоток дисоціації комплексу при електрофорезі. Таким чином, концентрація солей повинна бути оптимізована в залежності від конкретного експерименту. Багато експерименти з визначення рухливості в гелі РНК-білкових комплексах вивчаються в 50 mM трис-гліціновие буферах, а, наприклад, специфічні комплекси Escherchia coli вимагають принаймні додаткового додавання 150 mM Na і 5 mM Mg.
Якщо комплекс чутливий до підвищення сольовий концентрації, неспецифічне зв'язування може бути зменшено додаванням носія РНК [23].
1.3.1.3. Центрифугування в сахарозний градієнті
Центрифугування в градієнті сахарози є найбільш простим, але в теж час менш чутливим методом аналізу РНК-білкових комплексів, основним достоїнством якого є значно більші можливості при виборі іонних умов, ніж, наприклад, при використанні електрофоретичної методів. При застосуванні можливе формування спеціальних градієнтів, таких як изокинетический градієнт для визначення коефіцієнтів седиментації. p> Найбільш поширеним типом градієнта є лінійний градієнт сахарози. Оскільки рібонуклеопротеіновие комплекси більш щільні в порівнянні з максимально можливої вЂ‹вЂ‹щільністю сахарози (1.3 г/мл), вони завжди утворюють осад у нижній зоні. Так що вибір градієнта для поділу визначається залежністю від кількості обложеної частини: 5-20% (w/w) градієнт зазвичай вибирається для поділу малих нуклеопротеїнів, 10-30% (w/w) градієнт - для розділення сплайсосом, рибосомних субодиниць і Монос, оскільки 20-47% (w/w) градієнт - для об'єктів полісомних розмірів [23].
1.3.2. Фізичні методи
Засновані на вирішенні просторових структур РНК-білкових комплексів з атомарним дозволом. До цих методів відносять метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і метод рентгеноструктурного аналізу. p> Метод ЯМР дозволяє бачити структуру макромолекули в розчині без обмежень на взаємне розташування атомів, що накладаються кристалічної упаковкою. В даний час через складність і величини РНК білкових комплексів сфера його застосування сильно обмежена. p> Найбільш ефективним і універсальним методом визначення тривимірної структури РНК-білкових комплексів з атомним дозволом є рентгеноструктурний аналіз. Метод заснований на властивості біологічних макромолекул утворювати монокристали...
