ення. p align="justify"> Перед фотометрією готують стандартну пробу, для чого в пробірку вносять 0,1 мл фосфатного буфера, 0,9 мл трихлороцтової кислоти, 1 мл реактиву молібдату амонію і 1 мл розчину аскорбінової кислоти. Вміст перемішують, потім додають з бюретки 7 мл дистильованої води і знову перемішують. Залишають стояти 5 хв для розвитку фарбування. p align="justify"> Фотометрують дослідну і стандартну проби проти контрольної (1 мл трихлороцтової кислоти і 9 мл дистильованої води) на ФЕК при 630-690 нм (червоний світлофільтр) в кюветі з товщиною шару 0,5 см.
Розрахунок. Зміст неорганічного фосфору х (у мкмоль) у пробах розраховують за формулою
Еоп? 10
х = -----
Їсть
де Еоп - екстинкція дослідної проби;
Їсть - екстинкція стандартної проби;
- кількість неорганічного фосфору в стандартній пробі, мкмоль.
Спад Фн розраховують за різницею між кількістю його в стандартній і відповідної дослідної пробах.
Оформлення роботи. Отримані дані внести в таблицю. br/>
№ пробиСубстрат окісленіяРазобщітелі і інгібіториСодержаніе Фн в пробі, мкмольУбиль Фн, мкмоль
У висновку вказати можливість протікання окислювального фосфорилювання без субстрату окислення і особливість дії на нього разобщітелей та інгібіторів; відзначити практичне значення виявлених феноменів.
Практичне значення роботи. Клітини і тканини організму людини відрізняються один від одного швидкістю дихання і пов'язаного з ним фосфорилюванням. Найбільш активне окисне фосфорилювання наголошується в тканинах, багатих мітохондріями, наприклад, в нирках, сітківці ока, кірковій речовині головного мозку, серці, печінці; менш розвинений цей процес в скелетних м'язах, шкірі, а в еритроцитах людини він взагалі відсутній. У клініко-біохімічних дослідженнях використовуються методи визначення окисного фосфорилювання в лейкоцитах крові і біоптату для оцінки енергетичного обміну при різних патологічних станах, а також для вивчення дії ліків і отрут, які можуть проявляти властивості разобщітелей або інгібіторів. br/>
Робота 41. Виявлення гліколізу в м'язовій тканині
Для оцінки внеску гліколізу в енергетику клітин вимірюють швидкість цього процесу при оптимальних умовах. З цією метою додають у середу, що містить досліджуваний матеріал (клітини, зрізи або шматочки тканин, гомогенат тканини), один з субстратів гліколізу (глікогенолізу), найчастіше глюкозу, глікоген, фруктозобісфосфат та ін, необхідні кофактори і створюють анаеробні умови. Обов'язковим компонентом при вивченні швидкості гліколізу є неорганічний фосфат, який витрачається в цьому процесі на утворення АТФ з АДФ. Індикаторами гліколізу служать швидкість убутку глюкози або накопичення молочної кислоти, а також споживання Фн при анаеробному розпаді вуглеводів в тканинах. p align="justify"> Реактиви. Фосфатний буфер, 0,1 М розчин з рН 8,0 *; глюкоза, 10 г/л розчин, свіжоприготований; трихлороцтової кислота, 100 г/л розчин; сульфат міді (II), 100 г/л розчин; сірчана кислота, конц .; гваякол, 1,0 г/л розчин в 70%-ном етанолі; про-толуїдиновий реактив *; фторид натрію, 3 М розчин; вазелінове масло; оксид кальцію, порошок, навішування по 0,25 г у паперових пакетиках.
Обладнання. Водяна баня з лабораторним термометром; штатив із пробірками; піпетки місткістю 1 і 2 мл; очні піпетки; воронки з складчастими паперовими фільтрами; скляні палички; аптечні ваги з важками. p align="justify"> Матеріал. М'язова тканина (свіжа) забитої тварини. p align="justify"> Метод заснований на виявленні убутку глюкози і накопичення молочної кислоти в середовищі під дією ферментів гліколізу м'язової тканини в присутності і під час відсутності фториду натрію, що є інгібітором гліколізу. Глюкоза виявляється по реакції з о-толуидина, в результаті чого утворюється забарвлене з'єднання зеленого кольору при нагріванні в середовищі з оцтової кислотою. Молочна кислота при нагріванні з концентрованою сірчаною кислотою перетворюється на ацетальдегід, який дає з гваяколом характерне червоне забарвлення. p align="justify"> Хід визначення. У третій пробірки відмірюють по 2 мл фосфатного буфера і по 1 мл розчину глюкози. Потім в першу пробу додають 1 мл розчину трихлороцтової кислоти, а в другу - 0,2 мл розчину фториду натрію. p align="justify"> М'язову тканину дрібно подрібнюють ножицями і вносять у всі пробірки по 1 г м'язової кашки, вміст ретельно перемішують скляною паличкою і доливають 10 крапель вазелінового масла (для захисту від кисню повітря). Пробірки витримують на водяній бані при 37? С протягом 30 хв. Після інкубації в другу і третю проби додають по 1 мл розчину трихлороцтової кислоти і перемішують. p align="justify"> Вм...
