в в дихального ланцюга мітохондрій. Метод виявлення цитохромоксидази реактивом НАДІ використовується в клініці і цитології для виявлення цього ферменту в біоптатах і мазках клітин крові з метою діагностики порушень тканинного дихання. br/>
Робота 40. Демонстрація процесу окисного фосфорилювання і дії на нього разобщітелей
Для дослідження окислювального фосфорилювання визначають величину поглинання кисню в тканинах і одночасно спад доданого в середу неорганічного фосфату. Це дозволяє обчислити коефіцієнт фосфорилювання - Р/О. Споживання кисню тканинами при окисленні субстратів не є достовірним показником інтенсивності окисного фосфорилювання, оскільки кисень витрачається і в інших, немітохондріальних, реакціях. Крім того, активна утилізація його ще не означає аналогічного за інтенсивністю фосфорилювання, тобто пов і два процеси можуть бути в тій чи іншій мірі роз'єднані. Використання неорганічного фосфату в реакції етерифікації: Фн + АДФ? АТФ відбувається не тільки в ході окисного фосфорилювання, а й у гликолизе. При відсутності в середовищі субстратів гліколізу або при інгібуванні його і при створенні необхідних умов для функції дихального ланцюга мітохондрій можна вважати, що майже весь Фн витрачається в ході окисного фосфорилювання і його спад є індикатором цього процесу. p align="justify"> Реактиви. Хлорид калію, 0,15 М розчин; К-фосфатний буфер (рН 7,4), приготований з KH2PO4 (вміст неорганічного фосфору 0.1 моль/л); малат натрію, 0,16 М розчин; хлорид магнію, 0,6 М розчин ; фторид натрію, 5,7 М розчин; АДФ, динатрієва сіль, 9,1? 10-2 М розчин; сукцинат натрію, 0,3 М розчин; 2,4-дінітрофенол, 0,01 М розчин; азид натрію, 1 М розчин; трихлороцтової кислота, 10%-ний розчин; реактив молібдату амонію *; аскорбінова кислота, 1%-ний розчин на 0,1 М розчині соляної кислоти.
Обладнання. Штатив із пробірками; гомогенізатор з товкачиком з тефлону; моторчик для гомогенізації; піпетки місткістю 1 мл; бюретка місткістю 25 мл; скляні палички; воронка із складчастим паперовим фільтром; водяна баня з лабораторним термометром або лазня апарату Варбурга; годинник; ФЕК.
Матеріал. Печінка білого щура. p align="justify"> Метод заснований на вимірюванні витрати доданого неорганічного фосфату Фн в ході реакції окисного фосфорилювання в мітохондріях, що містяться в гомогенатах печінки.
Використання Фн в гликолизе блокується містяться в середовищі інкубації фторидом натрію.
Про дію разобщителя (2,4-дінітрофенол) і інгібітору (азид натрію) окисного фосфорилювання також судять по убутку неорганічного фосфату в присутності малата як субстрату окислення.
Неорганічний фосфат утилізується за схемою
PO4 + АДФ? АТФ + H2O
Визначення вмісту Фн до і після інкубації засноване на реакції, наведеною в роботі 11.
Хід визначення. Тварина забивають, витягають печінку і занурюють її в чашку Петрі з розчином хлориду калію, що стоїть на льоду або на снігу. Ретельно промивають печінку від крові середовищем виділення і промокають фільтрувальним папером. p align="justify"> Наважку близько 2 г відмитої тканини печінки переносять на годинне скло або в чашку Петрі, що стоїть на льоду, і дрібно подрібнюють ножицями. Подрібнену тканина поміщають у склянку гомогенізатора, куди попередньо налито 18 мл охолодженого розчину хлориду калію. p align="justify"> Стакан гомогенізатора поміщають в лід або сніг, що знаходиться в мішечку.
Тканина гомогенізують протягом 40-50 с при обертанні маточки 800-1200 об/хв, роблячи 40-50 рухів стаканчика вгору-вниз.
У п'ять пробірок наливають по 1 мл інкубаційної суміші наступного складу.
КомпонентиСостав суміші (в мл) в пробірках12345К-фосфатний буфер (рН 7,4) 0,30,30,30,30,3 Малат натрія0 ,1 - 0, 10,1 Сукцинат натрію-0, 1 --- Хлорид магнія0, 10,10,10,10,1 Фторид натрія0, 10,10,10,10,1 АДФ? Na20, 10,10,10,10,1 Дистильована вода0, 30,30,40,20,22 ,4-динитрофенола --- 0 ,1-Азид натрію ---- 0, 1
Вносять у всі проби по 2 мл отриманого гомогенату печінки, перемішують скляною паличкою і поміщають в штатив водяної бані при 37 Вє С, забезпеченою пристроєм для струшування пробірок. Відзначають час початку інкубації. p align="justify"> Через 30 хв інкубації реакції у всіх пробах зупиняють, додаючи до кожної по 1 мл розчину трихлороцтової кислоти. Вміст їх перемішують і фільтрують в інші пробірки через складчастий паперовий фільтр. p align="justify"> З кожної проби відбирають по 1 мл безбілкового фільтрату в чисті пробірки і доливають до них по 1 мл реактиву молібдату амонію і за 1 мл розчину аскорбінової кислоти. Перемішують вміст скляною паличкою, потім з бюретки додають по 7 мл дистильованої води і знову перемішують. Залишають стояти +5 хв для розвитку забарвл...
