аратів, що містять аденіннуклеотидів. br/>
Робота 43. Визначення активності креатинфосфокінази в сироватці крові по Еннору і Розенбергу
Реактиви. Креатинфосфат, 0,006 М розчин; аденозиндифосфат динатрієва сіль, 6,0 г/л розчин; трис-буфер, 0,1 М розчин з рН 7,2, що містить 0,1 моль/л хлориду магнію; сульфат цинку, 50 г/л розчин; гідроксид барію, 50 г/л розчин; лужної реактив, що містить 160 г/л карбонату натрію і 60 г/л гідроксиду натрію; діацетил, робочий розчин; ? - нафтол, 10 г/л розчин; креатин, стандартний розчин концентрації 0,1 ммоль/л.
Примітка. Всі перераховані реактиви, крім трис-буфера, готують перед вживанням. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; скляні палички; піпетки місткістю 1 мл; водяна баня з лабораторним термометром; центрифуга лабораторна з Центрифужна вагами. p align="justify"> Матеріал. Сироватка крові. p align="justify"> Метод заснований на визначенні креатину, що утворюється з креатинфосфату під дією креатинфосфокінази, про активність якої судять за кількістю виявляемого креатину.
В
Креатин утворює з діацетілом і ? - нафтолом комплексне з'єднання, інтенсивність рожево-жовтого забарвлення якого пропорційна концентрації креатину.
Хід визначення. У дві пробірки послідовно вносять наступні реактиви (обсяги розчинів вказані в мілілітрах):
РеактівОпитная пробіркаКонтрольная пробіркаТріс-буфер0, 20,2 Дистильована вода0, 20,3 Креатінфосфат0, 10,1 Сироватка крові0, 1 -
Обидві пробірки поміщають на 3 хв у водяну баню при 37 Вє С, не виймаючи з лазні, додають в них за 0,2 мл розчину АДФ (запускають креатінкіназную реакцію). Відзначають час початку інкубації. p align="justify"> Через 30 хв реакцію зупиняють, послідовно додаючи в обидві проби по 0,2 мл гідроксиду барію та сульфату цинку. Вміст пробірок охолоджують і залишають стояти 10 хв (для осадження білка). Потім осад відокремлюють центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 5-10 хв. p align="justify"> Відбирають по 0,5 мл надосадової рідини в дві чисті пробірки і доливають у них по 3 мл дистильованої води, по 1 мл розчину ? - нафтола і по 0,5 мл робочого розчину диацетила. Проби ретельно перемішують скляною паличкою і поміщають на 20 хв в темне місце для розвитку фарбування.
Перед фотометрією готують стандартну пробу і контроль стандарту. Для цього в одну пробірку (стандартна проба) вносять 0,5 мл розчину креатину, 3 мл дистильованої води, 1 мл ? - нафтола і 0, 5 мл робочого розчину диацетила, а в іншу (контроль стандарту) - ті ж реактиви, тільки замість розчину креатину додають 0,5 мл дистильованої води. Обидві пробірки витримують у темряві 20 хв.
Вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної і стандартною проти контролю стандарту на ФЕК при 520-540 нм (світлофільтр зелений) в кюветі з товщиною шару 1,0 см.
Розрахунок. Активність креатинфосфокінази розраховують за формулою
0,00005 Еоп1, 2? 2? 10000
х = ------------,
Ест0, 5
де х - активність креатинфосфокінази, ммоль/(год? л);
, 00005 - утримання креатину в стандартній пробі, ммоль;
Еоп - екстинкція дослідної проби проти контролю;
Їсть - екстинкція стандартної проби проти контролю стандарту;
- коефіцієнт перерахунку на годину інкубації;
, 2 - обсяг проб до центрифугування;
, 5 - обсяг надосадової рідини, взятої на дослідження;
- коефіцієнт перерахунку на літр сироватки крові.
Після скорочення формула набуває наступний вигляд:
2,4 Еоп
х = ----
Їсть
Оформлення роботи. Розрахувати активність креатинфосфокінази в сироватці крові і за отриманими даними зробити висновок про можливі зміни активності ферменту і причини цих відхилень. p align="justify"> Практичне значення роботи. Найбільше креатинфосфокінази в м'язовій (скелетна м'яз і серце) і нервовій тканинах, в яких вона бере участь в перенесенні енергії. В інших тканинах і органах її активність в 100-1000 разів нижче. Тому при пошкодженні м'язової і нервової тканин або при захворюваннях, що викликають підвищення їх проникності, має місце В«витікВ» ферменту з тканин і підвищення його кількості в крові. У нормі активність креатинфосфокінази в сироватці крові становить 0,30-...
