. p align="justify"> Матеріал. Листя рослин, свіжі. p align="justify"> Метод заснований на безперервному вимірі світлопоглинання бензидинової сині, що утворюється при окисленні бензидина під дією пероксидази.
Реакція описується рівнянням.
В
Хід визначення. Наважку 100 мг рослинного матеріалу поміщають в ступку і розтирають, додаючи порціями 10 мл дистильованої води. Розтерту масу переносять у мірну колбу місткістю 25 мл і доводять водою до мітки. Вміст колби настоюють 10 хв, потім зливають в центрифужні пробірки і центрифугують 10 хв при 3000 об/мін. p align="justify"> Для визначення активності ферменту беруть кювету з товщиною шару 2 см і наливають в неї по 2 мл водної витяжки з листків, ацетатного буфера і розчину бензидина. Ставлять кювету в кюветодержатель і встановлюють стрілку приладу на нульову позначку, потім додають 2 мл розчину пероксиду водню піпеткою з широким носиком (щоб сильний струмінь перемішала рідину в кюветі) і одночасно з додаванням пероксиду включають секундомір. Розчин в кюветі починає синіти і в міру наростання інтенсивності забарвлення стрілка приладу відхиляється. Відзначають час від початку пріліваніем розчину пероксиду водню до досягнення стрілкою гальванометра позначки 0,250. Повторюють визначення тричі і беруть середнє значення часу. p align="justify"> Розрахунок. Активність ферменту розраховують за формулою
? Е 25? 1000
х = --------
t? d 0,1? 2
де х - активність пероксидази, Е? с-1? кг-1 (Е - одиниця екстинкції);
? Е - зміна екстинкції, рівне 0,250, - час реакції, с; - товщина шару кювети, рівна 2,
- коефіцієнт перерахунку грамів у кілограми;
, 1 - навіс, г;
- обсяг проби, мл.
Після скорочень формула приймає вигляд
15625
х = -----
t
Оформлення роботи. Розрахувати і порівняти активність пероксидази в досліджуваному матеріалі; у виведенні відзначити біологічне значення ферменту. p> Практичне значення роботи. Пероксидаза виконує дві функції: власне Пероксидазну, тобто окисляє речовини за участю пероксиду водню, і оксидазную, тобто каталізує окислення субстратів за рахунок молекулярного кисню без участі пероксиду водню. Цей фермент проявляє перокісдазную активність щодо практично всіх фенолів (пірокатехін, пирогаллол, галова кислота, гваякол та ін), ароматичних амінів (бензидин, n-фенілендіамін та ін), аскорбінової кислоти, нітритів і т.д.
Водночас пероксидаза, володіючи оксидазної функцією, здатна брати участь в окисленні флороглюцину, НАД? Н2, НАДФ? Н2, индолилуксусной кислоти, оксалату, фенілпірувата і т.д.
У практиці широко використовують визначення активності пероксидази для оцінки метаболізму ростових речовин, лігніну та інших вторинних продуктів обміну при фізіологічних і патологічних процесах. Пероксидаза, виділена з хрону, широко використовується як аналітичний реагент при проведенні клініко-біохімічних досліджень. Тому метод вимірювання активності ферменту необхідний для контролю якості продажного препарату ферменту. br/>
ОБМІН ВУГЛЕВОДІВ
Методи дослідження обміну вуглеводів необхідні для діагностики цукрового діабету та інших ендокринних захворювань, ензимопатій, функції печінки, нирок і т.д. Одним з інформативних показників стану вуглеводного обміну є рівень глюкози в крові, дослідження якого найчастіше проводиться в клініці. Рідше вдаються до вивчення змісту інших цукрів і глікогену, а також до визначення концентрації молочній та піровиноградної кислот. При спадкових порушеннях метаболізму вуглеводів відому діагностичну цінність представляє визначення активності беруть участь у ньому ферментів. br/>
Робота 46. Визначення вмісту глюкози в крові о-толуїдиновим методом
Реактиви. Трихлороцтової кислота, 30 г/л розчин; про-толуїдиновий реактив *; глюкоза, основний стандартний 27,8 мМ розчин, свіжоприготований. p align="justify"> Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1, 1 і 5 мл; водяна баня; центрифуга з Центрифужна вагами; ФЕК. p align="justify"> Матеріал. Кров, взята з пальця. p align="justify"> Метод заснований на здатності глюкози при нагріванні з про-толуидина в розчині оцтової кислоти давати зелене забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації глюкози.
Хід визначення. У центрифужну пробірку відміряють 0,9 мл розчину трихлороцтової кислоти. З пальця обстежуваного беруть мікропіпеткою 0,1 мл крові і видувають у пробірку з трихлороцтової кислотою. Суміш у пробірці перемішують струшуванням і центрифугують 10 хв при 3000 об/хв. p align="justify"> Відбирають 05 мл центріфугута в іншу пробірку і додають в неї 2 мл о-толуїдинового реактиву. Пробірку поміщають в киплячу водяну баню на 8 хв, після чого охолоджують під струменем холодної води. ...
