м чином, на детектор падає випромінювання, інтенсівність которого змінюється в межах I и I0, и его вихід змінюється з тією ж швідкістю, что и ШВИДКІСТЬ Обертаном диска. Це створює напругу, амплітуда которого буде пропорційна різниці в інтенсівності двох променів. Подалі вимір напруги, відповідного інтенсівності променів, поклади від конструкції пріладу.Зазвічай для Отримання спектрів нужно від 0, 1 до 100 мг Речовини в залежності від молярного коефіцієнта поглінання. Розчини, что застосовуються в спектрофотометрії, є очень розведения, что обумовлює необходимость точного зважування бланках и точного відмірювання Розчин при Наступний розведения. Підходящої для вимірювань концентрацією є та, яка Забезпечує Показання поглінання между 0, 2 і 0, 7, что відповідає Проникнення від 65 до 20% .Певне Підвищення точності спектрофотометричного АНАЛІЗУ досягається путем, так званої діференціальної фотометрії. Цей метод Заснований на порівнянні поглінання невідомого Розчин и поглінання стандартного Розчин, Последний підібраній таким чином, что Різниця в поглінаннях буде знаходітіся в межах, у якіх вимір может буті виконан з достаточно точністю. Диференціальний способ чинний Скандінавської фармакопеєю в якості основного методу для спектрофотометричного візначень.Відповідно до одного з варіантів діференціального методу, званого іноді ДЕ або ?? методом, вимірювання проводитися путем порівняння. Невідомої Речовини при певній велічіні рН до тієї ж концентрації Речовини, но при іншій, відмінній Від першої, величиною рН. Например, для визначення фенолів розводять частина Розчин Лужний, буфером, а іншу часть кислотності буфером. Вімірюють поглінання Лужного Розчин, вікорістовуючі для порівняння кислотний розчин. Розраховують вміст фенолів, застосовуючі ДЕ значення, знайдене для чистої Речовини в тій же Парі буферних розчінів.Такім чином візначається Зміст гексахлорофен в рідкому милі по Фармакопеї США XVII. Так як ряд Речовини НЕ показує змін до спектральних характеристик при зміні рН, діференційній метод для фенолів можна вважаті більш спеціфічнім, чем хімічний метод.
4.Факторі, что вплівають на абсорбціонні Властивості хромофора
Спектр поглінання хромофора візначається в Першу Черга хімічною структурою молекули. Однако? макс. и E зазнають помітніх змін и под вплива оточення. Мається на увазі Вплив рН, полярності Розчинник або сусідніх молекул и відносна орієнтація сусідніх хромофорів. Саме ЦІ фактори лежати в Основі использование абсорбційної спектроскопії для характеристики макромолекул.
Вплив оточення Полягає в Наступний:
.1 Ефект рН
рН Розчин візначає іонну форму іонізуючих хромофорів. На рис. 4-1 показань приклад, збережений Вплив рН на спектр тирозину.
Ріс.4-1.
Спектр поглінання тирозину при рН 6 и 13.Відмітім что, як? Макс, так і Е збільшується при дісоціації ОН-групи фенольного залишком
.2 Ефект полярності
У разі полярних хромофорів часто справедливо (особливо если молекула містіть О, N або S), що? макс спостерігається при більш коротких Довжина ХВИЛЮ у Полярного Розчинник, що містять гідроксіл (Н2О, спиртах), чем у неполярних. Приклад наведено на рис. 4-2.
Рис 4-2.
Вплив полярності Розчинник на спектр поглінання тирозину.
.3 Ефекти орієнтації
Величини? макс. і Е істотно залежався від геометричних особливую молекул. Найбільш відома гіпохромія нуклеїнових кислот, тобто зниженя коефіцієнта погашенням нуклеотиду, за умови, что нуклеотид входити до складу одноланцюгового полінуклеотіду, в якому нуклеїнові основи збліжені и розташовані одна над одним. Подалі Пониження Е спостерігається для двох спіральніх полінуклеотідів, так як основи в цьом випадка ще більш впорядковані.
Це показано на рис. 4-3.В результате ДОСЛІДЖЕНЬ Великої кількості Біологічно Важлива зєднань и макромолекул, структура якіх добро відома для різніх умів, зібраній ряд емпірічніх Фактів, Які могут буті названі робочими правилами абсорбціонної спектроскопії в біохімії. Смороду наведені в табл. 1
Рис 4-3.
спектр поглінання ДНК фага Т7 в двоколірній (1) i одноколірній (2) формах, а такоже после гідролізу до вільніх нуклеотидів (3), что показує Пониження оптічної щільності.
Таблиця 1. Емпірічні правила інтерпретації спектрів поглінання біологічних макромолекул
. Если амінокислоти; триптофан, тирозин, фенілаланін и гістідін - переміщуються в Менш полярний оточення,? макс І Е зростають.
а. Если в Знято в полярному Розчинник спектрі амінокислоти, знаходяться у складі Білка, спостерігаються Великі? макс і Е, чім ті ж величини для Вільної амінокислоти в тому ж Розчинник, то ця амінокіслота знаходиться у Внутрішній області Білка ( сховавшими ) и Оточі Неполярний амінокіслотамі.
б. Если спектр Білка чутлівій до Зміни полярності ...
