Розчинник, амінокіслота, для якої спостерігаються Зміни? макс і Е, винна розташовуватіся на поверхні Білка.
. У разі амінокіслот? макс і Е всегда зростають, коли тітруєма група (например, ВІН тирозину и SH цістеїну) заряджена. Отже:
а. Якщо не спостерігається змін в спектрі однієї з ціх амінокіслот,
а рН таке, что мала б відбуватіся іонізація Вільної амінокислоти, то вона винна буті заховали в неполярній області молекули Білка.
б. Если значення рК іонізуючої групи амінокислоти, визначене за Зміни спектра при зміні рН, таке ж, як для Вільної амінокислоти в розчіні, то ця амінокіслота находится на поверхні Білка.
в. Если значення рК, визначене за Зміни спектра при зміні рН, істотно інше, то ця амінокіслота, ймовірно, знаходиться в очень полярному оточенні (например, тирозин, оточеній карбоксильними групами).
. Величина Е пурінів и пірімідінів зніжується у міру того, як плоскості їх кілець стають паралельних и кільця збліжуються одна з іншим. Величина Е зніжується в Наступний ряді: вільна основа gt; основа в складі одноланцюгового полінуклеотіда, что НЕ має сгекінга gt; основу в складі одноланцюгового полінуклеотіду зі стекінгом gt; основа у складі двохланцюгового полінуклеотіда.
5. ! Застосування абсорбційної спектроскопії у відімій и УФ-областях спектра
Вимірювання поглінання проводитися для багатьох цілей: визначення концентрації Речовини, АНАЛІЗУ Деяк хімічніх реакцій, ідентіфікації Речовини та визначення структурних параметрів макромолекул. Всі ЦІ Галузі! Застосування розглядаються в Наступний прикладах.
.1 Приклад 1. Вимірювання концентрації
Найбільш часто через вимірювання поглінання проводять для визначення концентрації .Це можна делать, если відомій молярна коефіцієнт Погашення и дотрімується закон Бера. Например, для двохланцюгового ДНК D260=1 відповідає 50 мкг/мл (ця величина покладів від нуклеотидного складу). Оскількі закон Бера дотрімується прінаймні до D=2 (яка наближається до Межі для більшості спектрофотометрів), легко підрахуваті концентрацію, а самє: D, рівна 0, 5, відповідає 25 мкг/мл, D, рівна 0, 1, відповідає 5 мкг/ мл и т. д.
Іноді досліджуваній материал складається з частінок, поглінаючого світла и утворюють швідше суспензію, чем розчин; Наприклад: у разі бактеріофагів, поглінання почти Цілком візначається вмістом у них ДНК.
Бактеріофагі НЕ только поглінають, альо такоже ї розсіюють світло (релляївське розсіювання) І, отже, могут мати штучно завіщене поглінання.
Однак, вімірюючі поглінання при ряді Довжина ХВИЛЮ, далеких від? макс, можна сделать поправку на розсіювання. Так як розсіяння змінюється пропорційно?- 4, можна побудуваті залежність вімірюваного поглінання від?- 4 І, екстраполюючі лінійну часть цієї крівої (де все спостережуваного поглінання обумовлення розсіюванням) до? макс, внести поправку в вімірюване поглінання, что дорівнює велічіні, обумовленої розсіюванням. Приклад подобной поправки збережений на рис. 5.
Рис. 5.
Це Зручний метод визначення вмісту нуклеїнової кислоти в бактеріофага; Враховується такоже, что D260 (з поправкою на розсіювання)=1 відповідає концентрації ДНК 50 мкг/мл.
Концентрацію бактерій такоже часто визначаються спектрофотометричного методом, хоча при вікорістовуваніх Довжина ХВИЛЮ все поглінання обумовлено розсіюванням. У цьом випадка вместо поправки на розсіювання проводитися співставлення спостережуваної оптічної щільності з кількістю жіттєздатніх клітін и будується калібрувальна крива. Таким Шлях, як показано на рис. 5-1, вдається точно візначіті концентрацію клітін або сухої масі на одиницю об'єму.
Рис .5-1.Концентрація бактерій, определена путем вимірювання оптічної щільності.
.2 Приклад 2. Дослідження хімічніх реакцій
У ході Реакції має змінюватіся поглінання одного Із реагентів. Розглянемо вимір актівності ферменту-галактозидази. Ця методика широко вікорістовується в молекулярній біології при вівченні Функціонування лактозного опероном. Цей фермент розщеплює 0-нітрофенілгалактозід (ОНФГ) з утвореннями о-нітробензолу, Який можна візначіті за его поглінання при 420 нм. Так як, в Деяк інтервалі, ШВИДКІСТЬ Реакції пропорційна концентрації ферменту, з нахилится крівої залежності D від годині гідролізу (рис. 5-2) можна візначіті Кількість ферменту.
Рис. 5-2 .час после Додавання стимулятора.
Вивчення синтезу -галактозідазі путем вимірювання D420 продукту гідролізу о-нітрофенілгалактозіда (ОНФГ). Три культури: Lac-, Lac + і диплоїд, містіть две копії генів lас, вірощуваліся в гліцерин-сольовому середовіщі.Прі t=O БУВ Доданий стимулятор синтезу -галактозідазі. Через відмінні проміжкі годині брали проби и обробляємих толуолом для того, щоб вбити Клітини и відокреміті фермент, потім БУВ Доданий ОНФГ. Через тридцять хвилин булу вім...
