повідь В«такВ» чи В«ніВ», як, наприклад, при первинному виявленні інфекційних збудників, судово-медичних дослідженнях, визначенні генних мутацій, специфічних онкогенів та ін Звичайним способом поділу продуктів ПЛР та ідентифікації специфічного гена є електрофорез в агарозному або (рідше) поліакриламідному гелі. Методики електрофоретичного розділення досить стандартизовані і дають цілком відтворювані результати. Результат повинен бути безумовно негативним у контролі без досліджуваної ДНК і позитивним - у пробі з ДНК, що містить шуканий ділянку гена. Позитивний контроль може являти собою цільову ДНК або ділянка гена, клонований в плазміді або ампліфікований за допомогою ПЛР
Для обліку результатів якісної ПЛР може бути використаний і метод флуоресцентної детекції. Для цього по закінченні ПЛР визначають наявність або відсутність специфічного сигналу за допомогою спеціальних Флуоріметри (так званий flash-метод). Оскільки тут немає необхідності і в електрофоретичному обладнанні, то очевидна істотна економія робочих зон та реагентів для лабораторії.
Методи обліку результатів ПЛР без застосування електрофорезу найбільш доречні і вигідні для багатопрофільних лабораторій, де ПЛР-методи становлять лише деяку частину загального виробничого процесу. p> У таких великих лабораторіях часто визначається лише обмежене коло найбільш затребуваних мікроорганізмів. На російському ринку пропонується цілий ряд flash-наборів для діагностики захворювань, передаються статевим шляхом, і ряду вірусних інфекцій. Цей асортимент патогенів цілком достатній для багатьох лікарняних лабораторій, і вони можуть з початку своєї діяльності зробити акцент на подібних методах аналізу.
Кількісна оцінка результатів ПЛР
У ряді клінічних ситуацій виникає питання про динаміці патологічного процесу та/або ефективності проведеної терапії. Ці питання найбільш актуальні при обстеженні пацієнтів з хронічними інфекціями (Гепатити В і С, вірус імунодефіциту людини тощо). При діагностиці виходять з того, що накопичення продуктів ПЛР (амплікон) пропорційно вмісту копій шуканого гена в досліджуваній пробі.
Природно, облік результатів кількісної ПЛР можна проводити і за допомогою гель-електрофорезу з аналізом інтенсивності специфічних сигналів ПЛР. Обов'язковою умовою правильної кількісної оцінки результатів ПЛР є надійні позитивні контрольні проби з відомим змістом копій шуканого гена (наприклад, 1000 копій гена гепатиту С на одну ПЛР-реакцію). Ряд послідовних розведень кількісного контролю дає можливість побудувати калібрувальні криві, за якими можна оцінювати зміст генокопії в клінічних зразках.
Ключовим досягненням у проведенні кількісної ПЛР стала розробка флуоресцентних ДНК-зондів, які додаються в реакційну суміш поряд з "звичайними" праімерамі і дають можливість відстеження ходу ПЛР в часі (так звана геа1-timе-ПЛР), яка в 1993-1994 рр.. була впроваджена в.соответствующіх приладах і діагностичних системах (принцип ТаqМаn...
