для електрофорезу, добре перемішують піпетуванням і інкубують при 96 В° С протягом 5 хв. Контрольний зразок інкубують при 65 В° С протягом 2 хв. Старі проби, які вже були проинкубировать при 96 В° С протягом 5 хв, також інкубують при 65 В° С протягом 2 хв.
Склад буфера для підготовки проб для електрофорезу (40 мл):
Нанесення досліджуваних проб на гель .10 мкл контрольного зразка наносять на першу доріжку гелю. На решту доріжки наносять по 10 мкл досліджуваних проб. Внутрішню і зовнішню камери електрофоретичної камери заповнюють буфером для електрофорезу NuPAGE MOPS/SDS і додають 500 мкл антиоксиданту (NOVEX) тільки у внутрішню камеру (мал. 7).
Склад буфера для електрофорезу:
Електрофорез . Електрофорез проводять при 200 V протягом 30 хв, поки фарба не виявиться на відстані 1-2 см від краю гелю.
блотинг.
Підготовчі етапи:
В· необхідно змочити PVDF-мембрану (Millipore, Immobilon-P, 0,45 мкм) метанолом протягом декількох секунд, потім помістити в буфер для блотингу на 10 хв;
В· камеру для блотингу слід наповнити охолодженим (+4 В° С) буфером для блотингу.
Склад буфера для блотингу (10х):
Тріс 30,28 гГліцін144, 13 гДістіллірованная водадо 1000 мл
Перед використанням до 100 мл 10х буфера для блотингу додають 900 мл дистильованої води і 100 мл метанолу. Зберігають при + 4 В° С.
Збірка сендвіча "для блотингу :
В· на губку поміщають лист фільтрувального паперу, змочують його бидистиллированной водою, і наверх кладуть мембрану;
В· витягують гель з рамки, видаляють його верхню частину, що містить прорізи, і нижню частину нижче фронту фарби. Гель акуратно поміщають на мембрану, уникаючи попадання бульбашок повітря між ними. До 6 гелів може бути поміщене на 1 мембрану розміром 15 х 18 см;
В· наверх на гелі кладуть змочений бидистиллированной водою лист фільтрувального паперу, потім - губку;
В· Зібраний ...
