an align="justify"> блотинг;
Г? обробка антитілами;
Г? прояв реакції;
Г? облік реакції;
Г? інтерпретація результатів.
Техніка постановки иммуноблотинга
Відбір, гомогенізація і ферментне руйнування проби.
Відбір проб. Для діагностики губкоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби використовується довгастий мозок тварин. Відбір проб проводиться через отвір потиличної кістки за допомогою спеціальної ложечки.
Гомогенізація . Шматочок довгастого мозку з області засувки масою 0,45-0,7 г поміщають в 50 мл пробірку і за допомогою ваг визначають точну вагу проби. До шматочку мозку додають 10-кратний об'єм буфера для гомогенізації. Потім проба гомогенізується протягом 1 хв за допомогою гомогенізатора при 20000 об/хв.
Ферментне руйнування . У зв'язку з тим, що пріони PrP Sc стійкий до протеїнази К, важливим моментом є його ферментація. Для цього в 96-ямковий планшет з об'ємом лунки 0,2 мл для ферментного руйнування вносять по 100 мкл кожного гомогената, додають 10 мкл протеїнази К (20 ОД/мл) і добре перемішують піпетуванням. Ферментне руйнування проводять при 48 В° С протягом 40 хв. Після інкубації додають 10 мкл останавливающего розчину для зупинки протеолітичної реакції.
Електрофорез.
Принцип електрофорезу білків в гелі заснований на явищі просторового розділення білків при їх русі в електричному полі. Білки, як біополімери, що володіють зарядом, переміщаються в електричному полі в напрямку протилежно зарядженого полюса. При цьому швидкість міграції білків в гелі залежить від їх заряду та молекулярної маси. Оскільки ці характеристики різні у різних білків, методом електрофорезу можна добитися розділення складної білкової суміші на окремі білки. p align="justify"> Денатурація. Денатурація білків призводить до порушення вторинної та третинної структур білка, розгортанню "молекули. При цьому заряд білка, його лінійні розміри і, отже, швидкість міграції білків в гелі стають прямо пропорційні їх молекулярній масі, що дає можливість точно її визначити, порівнюючи електрофоретична рухливість досліджуваного білка з електрофоретичної рухливістю білків з відомою молекулярною масою. Для цього до зруйнованим протеїназою До пробам додають PAGE-буфер по 100 мкл на лунку з метою підготовки проб ...
