. Для титрування використовували клітини лінії М - 19 (фібробласти людини). Кожну реакцію ставили в обсязі 200 мкл з двома повторами, загальна витрата цільної крові при цьому становив 200 мкл. В якості тест-вірусу використовували вірус везикулярного стоматиту (ВПС), штам Індіана. За одиницю активності ІФН брали величину, зворотну його розведенню, що затримує деструкцію моношару на 50%. У здорових донорів рівень загального сироваткового ІФН відповідав 2-8 од/мл, індукція ІФН -?/? в культурі лейкоцитів дорівнює 1280 од, ІФН-?- 256 од, при гострої вірусної інфекції сироватковий ІФН дорівнював 128 од/мл, продукція ІФН -?/?- 10 од, ІФН-?- 64 од. При хронічної вірусної інфекції ці показники становили: сироватковий ІФН 32-64 од/мл, продукція ІФН -?/?- 80 од, ІФН -? lt; 2 од. (Григорян С.С. Оцінка інтерферонового статусу людей по пробах цільної крові. Питання вірусології, 1988, т. 3, N 4, с. 433-436).
Суть винаходу полягає в тому, що для аналізу ІФН статусу в стерильні пробірки відбирають венозну кров об'ємом від 0.5 до 5 мл. У частину пробірок попередньо вноситься необхідну кількість стерильного гепарину у вигляді концентрованого (для виключення розведення вихідного зразка) розчину на середовищі RPMI - 1640 або на фізіологічному розчині, так, щоб кінцева концентрація гепарину склала 10-15 од/мл. Відібрана таким чином кров може зберігатися 5-6 годин при 4 o C без втрати всіх необхідних властивостей.
Цільну негепарінізірованную кров центрифугують 10-15 хв при 1000 g, після чого в стерильний Еппендорф відбирають 50-200 мкл сироватки для аналізу змісту загального сироваткового ІФН. Для типування ІФН у сироватці крові (ІФН -?, ІФН -?, ІФН -?) Зразки инкубируются з моноклональними антитілами (MAT) до різних типів ІФН протягом 1:00 при 37 o C. Зміст ІФН кожного типу визначають, виходячи з активності загального сироваткового ІФН і величини падіння активності ІФН у кожному зразку після інкубації з МАТ. Зразки зберігають при - 25 o C.
Для визначення вмісту кіслотолабільного ІФН -? в сироватці крові в досліджувані зразки додають розчин 0.1 н. HCl до pH 2.0, зразки інкубують протягом 1:00 при 37oC, після чого pH доводять до 7.4 додаванням 0.1 н. NaOH. Паралельно з цим, іншу аліквоту досліджуваного зразка інкубують з МАТ до ІФН -? 1:00 при 37oC для осадження сироваткового ІФН - ?. Зміст кіслотолабільного ІФН -? визначають як різницю активностей зразка, інкубувати з МАТ до ІФН - ?, і зразка, інкубували при pH 2.0. Зразки зберігають до аналізу при - 25oC.
Для визначення рівня продукції різних типів ІФН лейкоцитами крові in vitro у стерильні Еппендорфа вносять середу RPMI - 1640 з додаванням глутаміну, антибіотиків (пеніцилін, стрептоміцин до 100 од/мл), 2% сироватки ВРХ, розчини індукторів ІФН (5-7 lg ЕІД50 NDV для ІФН -? /?) і ентеротоксин St. aureus (СЕА, 10 мг/мл) для ІФН - і цільну гепаринизированную кров у співвідношенні 8/1/1 (наприклад, 100 мкл PRMI - 1640, 12.5 мкл розчину індуктора ІФН і 12.5 мкл цільної крові). Для визначення рівня спонтанної продукції ІФН замість розчину індуктора вносять еквівалентний об'єм живильного середовища. Отриману індукційну суміш інкубують 24 години при 37oC, потім в Еппендорф, в яких проводиться індукція ІФН -?/?, Додають 0.1 н. розчин HCl до pH 2.0, проби інкубують 1:00 при 37oC, після чого в них вносять 0.1 н. розчин NaOH до pH 7.4. Таким же чином обробляють проби спонтанно продукованого ІФН, в яких визначають зміст ІФН -? по падінню активності ІФН в скислої/відновленої пробі (її активність відповідає активності спонтанно-продуцируемого ІФН -? /?) в порівнянні із звичайною. Оброблені таким чином проби з індукованим і спонтанно продукувати ІФН зберігаються до аналізу при - 25oC. Безпосередньо перед аналізом проби, які зазнали закислению/відновленню (індукований і спонтанний ІФН ІФН -?/?, Центрифугують 10-20 хв при 3000-4000 g для осадження коагульованих макромолекул.
При визначенні індукованої продукції кіслотолабільного ІФН-? , Індукцію його синтезу проводять у тих же умовах і паралельно індукції загального ІФН -?/? з тією різницею, що замість закислення/відновлення після інкубації і NDV зразки інкубують з поликлональной сироваткою до NDV 1:00 при 37 o C. Оброблені таким чином проби центрифугують при 4000-7000 g для осадження NDV і зберігають до аналізу при - 25 o C.
Визначення активності інгібіторів/активаторів дії ІФН у фізіологічних рідинах виробляють спільним титруванням досліджуваного зразка на тлі постійної концентрації референс - препарату ІФН при інших умовах, відповідних звичайному титрованию (див. нижче). Активність інгібіторів/активаторів дії ІФН визначають по відношенню активності стандартного препарату ІФН до активності стандартного препарату тій же концентрації в присутності досліджуваної сироватки крові і висловлюють як коефіцієнт стимуляції. Зразки фізіологічних рідин (сироватка крові, цереброспінальної, синовіа...
