огут культівуватіся без фідерніх клітін. Ефективність висіву после ін єкції зазвічай зменшується на 10-70%, альо если вікорістовується ефективна техніка мікрокультівування, це не стає Великої проблеми, оскількі частоти трансформації очень Високі (у Середньому 15-25%). Гібрідізація по Саузерну показала, что трансформанта, Які утворюються з мікроін єкційованіх клітін, містять перенесеного ДНК, організовану так само, як при векторному перенесенні.
Незважаючі на опісані вищє проблеми в розробці методів мікроін єкцій для рослинних клітін, особливо протопластів, досягнутості великого прогресу. У ранніх дослідженнях проводили ін єкції в цитоплазму протопластів Тютюна при 70% віжіваності. У ціх експеримент вікорістовувалі Клітини дво-, тріденного віку, отрімані з протопластів, Які сформувалася тонких клітінну стінку и здатні прікріплюватіся до покрівного скла, покрита полі-? - Лізіном. За мікроін єкціямі спостерігалі, вводячі флуоресцентні барвник. Однако голка мікроін Ектор Рідко потрапляла в ядро ??через том, что при вікорістанні цього методу іммобілізації протопластів/клітін Важко локалізуваті ядра. З тихий пір повідомлялося, что полі-? - Лізин часто має токсичних дію по відношенню до протопластів.
Пізніша розробка Полягає в тому, щоб заплавляті протопластах в очень тонкий куля легкоплавкої агарози в нейлонові кільці. Завдяк даного методу іммобілізації, много протопластів знаходяться у поверхні агарозу и только частково оточені нею, так что їх неважко ін єктуваті. При цьом локалізація ядра - непроста задача. Перевага методу Полягає в тому, что протопластах (Клітини), что ін єкцюються, Вже знаходяться в культуральному середовіщі, что Забезпечує підтрімку їх жіттєздатності. Розроблення ще один метод, Який предполагает іммобілізацію протопластів помощью спеціально прізначеної утрімуючої піпеткі raquo ;. Протопласт можна втягнутості або звільніті, прікладаючі позитивний чи негативний Тиск до утрімучої піпеткі, з єднаної зі шприцом. Метод допускає маніпуляцію протопластами для оптімальної орієнтації ядра відносно ін єкційної піпеткі. Помощью даного методу іммобілізації Кроссвей з співавторамі Вперше показали можлівість трансформації клітін рослин путем ін єкції чужорідної ДНК.
Для Підвищення ефектівності трансформації до спеціфічної ДНК, что містіть ген, за Яким буде проводитися селекція, додається неспеціфічна ДНК - носій. Зазвічай для цієї мети беруть ДНК з тимуса теляті або сперми лосося. Частина ДНК зв'язується з мембраною и не потрапляє в Клітини. ДНК акцептують від 15 до 90% клітін. Через кілька діб после Введення невелика частко клітін здатні експресуваті чужорідні гени, альо потім рівень експресії падає и більш-Менш стабільної трансформації зазнає 10-3 - 10-5 клітін.
Для трансфекції вікорістовується и ДЕАЕ - декстран, полімер, что адсорбує ДНК. Ефект входження в Клітини і Час експресії Високі, но частота стабільної трансформації нижчих, чем при вікорістанні преціпітату кальцію. Частоту трансфекції збільшує гліцеріновій шок (4 хвилини в 15% розчіні гліцеріну в НEPES - буфері).
У Клітини можна вводіті будь-який ген, если Заздалегідь лігуваті его з клонованім селективних маркером. Однако подальші дослідження показали, что лігування поза Клітини НЕ обов'язково. Клітини, что поглінають селективних ген, вместе с ним поглінають и іншу ДНК, наявний в преціпітаті кальцію. Таким чином, користуючися методом котрансформації, практично буде клонованій сегмент ДНК можна ввести в культівовані Клітини еукаріот, если Включити Цю ДНК вместе с селективних маркером до складу суміші для Утворення кальцієвого преціпітату [5].
Для трансфекції можна використовуват хромосоми або фрагменти хромосом. Клітини-донори блокують на стадії мітозу. Мітотічні хромосоми вівільняються під вплива осматічного шоку и гомогенізації. Їх очіщають путем діференціального центрифугування. Хромосоми осаджують на поверхні клітін хлористим кальцієм, а через кілька годин обробляють реагентом, здатно перфоруваті мембрану (например, гліцеріном). трансформація тютюн мікроін єкція Брунькова
Для ОБРОБКИ клітін-рецепієнта Використовують грубо очищені препарати хромосом, так як хромосоми при цьом руйнуються найменша. Кількість хромосом для ОБРОБКИ 1 Клітини обмежена. Краще використовуват НЕ більше 20 хромосом на 1 клітіну-рецепієнта, так як при високих концентраціях хромосом в суспензії смороду агглютінуються. Рецепієнтна клітина містіть фрагменти Донорний хромосом, Які могут вбудовуватіся в геном, могут репліціюватісь самостійно. У введених фрагментах часто спостерігаються делеції.
Чи не всі Клітини здатні до трансформації геномної ДНК з скроню частотою. Людські фібробласті Ефективний включаються плазмідну ДНК и почти НЕ включаються геномну.
Мікроін єкція ДНК в Клітини ссавців стала можл...
