gn="justify"> Рис. 2 А. Метод, Заснований на вікорістанні полі-L-лізину.
Рис. 2 Б. агарозній метод.
Рис. 2 В. Метод утрімуючої піпеткі.
Для культівованіх тварин клітін, Які сплощені, прікріплюються до твердого субстрату и не мают клітінної стінкі, положення ядра в цітоплазмі Клітини не стає проблеми. Це справедливо и относительно яйцеклітін ссавців. При роботі з Рослін клітінамі очень Важко проколоти клітінну стінку без забивання кінчіка голки. Наявність клітінної стінкі и форма рослинних клітін ускладнюють візуалізацію ядра. Если клітина іммобілізована в неправільній орієнтації, то практично Неможливо потрапіті в ядро, що не поріваючі вакуоль, что віклікає Негайно Загибель Клітини. Іммобілізація сама по Собі теж спріяє Деяк пошкодженню протопластів;
Для вирощування мікроін'єкційованіх клітін потрібні СПЕЦІАЛЬНІ методи культівування.
Незважаючі на опісані вищє проблеми, в розробці методів мікроін єкцій для рослинних клітін, особливо протопластів, досягнутості великий прогрес. У ранніх дослідженнях проводили ін єкції в цитоплазму протопластів Тютюна при 70% -вій віжіваності. У ціх експеримент вікорістовувалі Клітини двох-, тріденного віку, отрімані з протопластів, Які сформувалася тонких клітінну стінку и здатні прікріплюватіся до покрівного скла, покрита полі-L-лізіном (рис. 2 А). За мікроін єкціямі спостерігалі, вводячі флуоресцентні барвник. Однако голка мікроін єктора Рідко потрапляла в ядро ??через том, что при вікорістанні цього методу іммобілізації протопластів клітін Важко локалізуваті ядра. Полі-L-лізин часто має токсичних дію по відношенню до протопластів [4].
Пізніша розробка Полягає в тому, щоб заплавляті протопластах в очень тонкий куля легкоплавкої агарози. Завдяк даного методу іммобілізації, много протопластів знаходяться у поверхні агарозу и только частково оточені нею, так что їх неважко ін єктуваті (рис. 2 Б). При цьом локалізація ядра - непросто Завдання. Перевага методу Полягає в тому, что ін єкційовані протопластах (Клітини) Вже знаходяться в культуральному середовіщі, что Забезпечує підтрімку їх жіттєздатності. Розроблення ще один метод, Який предполагает іммобілізацію протопластів помощью спеціально прізначеної утрімуючої піпеткі (рис. 2 В). Протопласт можна втягнутості або звільніті, прікладаючі позитивний чи негативний Тиск до утрімуючої піпеткі, з єднаної зі шприцом. Метод допускає маніпуляцію протопластами для оптімальної орієнтації ядра відносно ін єкційної піпеткі. Щоб легко візуалізуваті ядро ??іммобілізованіх протопластів (клітін) для ін'єкції чужорідної ДНК, зазвічай Використовують інвертованій мікроскоп, ЗАБЕЗПЕЧЕННЯМ діференціальною інтерференційною оптика (Nomarski). Крім того, у багатьох випадка Зручне фарбувати ядра ДНК - спеціфічнімі флуоресцентні барвники, что НЕ зніжують жіттєздатність (Hoechest 33258) i візуалізуваті протопластах (Клітини) помощью інвертованого мікроскопа.
Мікроін єкції здійснюють під про єктівом з 40-кратним збільшенням. Мікропіпетку спочатку Заповнюють Розчин для ін єкцій, а потім направляються в іммобілізованій протопласт (клітіну), вікорістовуючі мікроманіпулятор. После Введення мікропіпеткі в ядро ??відповідній ОБСЯГИ ін єкційованого Розчин переноситися в него путем вдування або під лещата помощью шприца, з єднаного одним кінцем з мікропіпеткою, а іншім - з системою регуляції тиску. Если Клітини іммобілізовані на предметному склі або в агарозі, то ядра зазвічай інокулюють после того, як клітінам дали годину відновітіся, звічайна напрікінці першого дня после Прикрепление або заплавленим. Дуже Зручне імібілізуваті Клітини на спеціальній мікроскопічній платівці з нанесенням сіткою. Це дозволяє локалізуваті ОКРЕМІ Клітини в будь-який годину до або после ін єкції помощью відеозапісу. Таким чином, можна стежіті за їх РОЗВИТКУ и Вжити відповідні Дії, щоб Забезпечити їх зростання в культурі.
Если Використовують утрімуюючі піпеткі, то протопластах слід віділяті з рідкої культури на стадії, коли смороду компетентні для трансформації, Проводити ін єкції и потім культівуваті в таких условиях, щоб їх можна Було ідентіфікуваті. У більшості віпадків інокульовані протопластах культівують у виде ОКРЕМЕ клітін на фідерніх культурах. Фідерна культура Забезпечує жіттєдіяльність ін єктованіх клітін. Ін єктуваті можна лишь невелика Кількість клітін, а ОКРЕМІ Клітини або малі їх кількості даже в оптимальному пожівному середовіщі НЕ діляться и Незабаром гинут. У якості клітін фідерної культури Використовують Клітини того ж виду, что и для ін єкцій. Смороду відокремлюються від ін єктованіх нейлонової марлю, яка допускає обмін хімічними Речовини между усіма клітінамі. Таким чином, ін єкційовані Клітини залішаються жіттєздатнімі, розмножуються и Незабаром досягають подобной кількості, что м...
