кодує фермент, що бере участь у синтезі тейхоевих кислот (гліцерол-3-фосфат цітіділтрансфераза). Ген tagD дикого типу був клонований в pSWEET (з утворенням pSWEET- tagD ) для експресії під контролем системи експресії xyl. Мутанти з інтегрованою в amyE за допомогою pSWEET- tagD системою експресії і геном tagD під її контролем були здатні до зростання при непермессівной температурі у присутності індуктора (ксилози). Тобто при зростанні при неперміссівной температурі відбувалася ксилозою-залежна комплементації даного температур залежного мутанта tag-12 . p> Таким чином було показано, що pSWEET є ефективною системою для точно регульованою експресії клонованих генів у B. subtilis і, зокрема нової ефективної системою експресії для умовної комплементації в B. subtilis .
В
1.3. Вектори для клонування промоторів
Найбільш зручні та універсальні системи створені для вивчення активності промоторів in vivo являють собою плазміду, несучу ген позбавлений промотора, що кодує продукти, що легко піддаються кількісному аналізу (ген-репортер). Фрагмент ДНК, чию промоторних активність необхідно проаналізувати, можна вставити перед геном репортером. По виходу продукту гена потім можна визначити активність даного промотору. Для грампозитивних бактерій сконструйовано ряд плазмідних векторів для вимірювання активності промоторів, де в якості гена-репортера виступає ген b-галактозидази або хлорамфенікол ацетилтрансферази (без промоторів). Головним недоліком цих векторів є їх висока копійность, що заважає їх використанню для точного вимірювання активності промотора in vivo . крім того, вони часто мають вузьке коло господарів.
Створено мобілізуються малокопійний човниковий вектор pTCV- lac (Poyart C., Tieu-Cuot., 1997) з широким колом господарів. p> Вектор сконструйований на основі двох репліконов - pACYC184 і pAMb1 (Рис.6), що дозволяє йому реплицироваться в клітинах E. coli і в широкому колі грампозитивних бактерій ( Bacillus , Enterococcus , Listeria , Streptococcus ). Точка початку перенесення плазміди RK2 забезпечує здатність до переносу при кон'югації з клітки-донора E. coli в різні грампозитивні бактерії. Роль гена-репортера виконує ген b-галактозидази (Без промотора). Вектор є у клітинах в кількості 3-5 копій на хромосому; дана малокопійность дозволяє точно вимірювати активність промоторів.
В
Рис. 6. Структура вектора pTCV- lac . oriR pACYC184 і oriR pAMb1 - rep-області плазмід pACYC184 і pAMb1, відповідно; ermB - ген стійкості до еритроміцину; aphA-3 - ген стійкості до канаміцину; lacZ безпромоторний ген, що кодує b-галактозидазу, з сайтом зв'язування рибосоми для грампозитивних бактерій ( spoVG ); ori T RK2, точка початк...
