у перенесення плазміди RK2. br/>
сконструйований вектор був використаний для порівняння активності чотирьох промоторів (P tac , P trc , P spac , P aphA - 3 ) у двох грампозитивних паличках ( B. subtilis і Listeria monocytogenes ) і двох грампозитивнихкоків ( Enterococcus faecalis і Streptococcus agalactiae ). Для цього здійснювалася вставка фрагментів EcoR I- BamH I в лінеаризованих шляхом рестрикції рестріктазами EcoR I і BamH I вектор. У всіх даних господарях похідні вектора виявилися стабільними. Показано, що активність досліджуваних промоторів, виміряна шляхом визначення активності b-галактозидази, сильно варіює залежно від виду господаря, в якому досліджується активність даного промотора. Ці дані показують, що вектор pTCV- lac можна успішно використовувати для аналізу регуляції генів в широкому колі грампозитивних бактерій.
1.4. Вектори з регульованою копійних
Сконструйовані вектори для грампозитивних бактерій, дозволяють зменшувати кількість їх копій на клітину (Renault et al., 1996). Ці вектори створені на основі pILnew - малокопійного вектора, побудованого на основі реплікону pAMb1, несучого ген резистентності до еритроміцину і здатного реплицироваться в більшості грампозитивних бактерією. Цей вектор, як і всі отримані з нього похідні, несуть реплікаційний регіон pAMb1, що містить необхідний для реплікації ген repE (кодує білок реплікації RepE) і його регулятор copF . Ген copF був инактивирован шляхом введення вставки в унікальний сайт Kpn I. Так як продукт copF надає репресує дію на експресію repE , його інактивація веде до збільшення копій плазмід на клітину приблизно в 20 разів. Первинний стан малокопійності може бути відновлено з допомогою видалення вставки шляхом його вирізання з Kpn I і подальшої зшивання. Вектор pILnew був використаний для створення (1) клонирующих векторів, (2) векторів для вивчення регуляції генів шляхом клонування їх промоторів і сайтів зв'язування з рибосомою, (3) векторів для експресії генів, (4) касет, що містять реплікон з різними полілінкерамі, які сприяють створенню нових векторів.
br/>
Рис. 7. Структура векторів. Позначення сайтів рестрикції: E ( Eco RI); B ( Bss HII); N ( Nde I); K ( Kpn I); B ( Bgl II). Em і Cm - гени стійкості до еритроміцину і хлорамфеніколу, відповідно. repE - ген, що кодує необхідний для реплікації білок RepE; orfD - ген-регулятор транскрипції repE; сopF - ген репрессора (CopF) транскрипції кластера repE - orfD ; P orfD - repE - промотор кластера repE - orfD ; P res - промотор гена резольвази res b. MCSpBS-частина MCS плазміди pBluescript; ...
