в ньому міститься 5-7 мг глюкози, фруктози і сахарози на 1 г сирої ваги тканини. Для встановлення оптимальної концентрації цукрів, що вносяться до пляма, ставлять окремо дві контрольні хроматограми з нанесенням різних обсягів досвідченого екстракту (0,01-0,04 мл в пляма). На ті ж смуги наносять також і мітчики - розчини цукрів (по 0,004 мл 2%-них розчинів). Після нанесення розчинів на папір приступають до поділу цукрів у відповідній суміші розчинників (н-бутанол - піридин - вода, 6:4:3; н-бутанол - оцтова кислота - вода, 4:1:5). Хроматографія спадна. Тривалість поділу 2-3 діб. Після поділу хроматограми висушують в струмі повітря (у витяжній шафі) до повного видалення слідів розчинника. Наступним завданням є визначення положення плям на основної частини хроматограми, так як цукру елююють з непроявленої частини папери. Для цього від основної хроматограми відрізають контрольні смуги (а), (б) і (в) і обприскують дві з них, наприклад (а) і (б), проявниками на кетози - резорцінфосфатом (Реакцією Ф.Ф. Селіванова):
В
або розчином N-хлормочевіни:
В
а (В) - проявником на альдози - анілінфталатом (аніліноксалатом):
В
Смугу, обприскати резорцінфосфатом, прогрівають 3-4 хв. в сушильній шафі при температурі 85-95 Вє С. Плями фруктози, сахарози, рафінозі і олігосахаридів, містять фруктозу, фарбуються в інтенсивно рожевий колір. При нагріванні хроматограми, обприскати розчином хлормочевіни, протягом 5 хв. при 105 Вє С плями Альдози приймають синє забарвлення. Смугу, оброблену розчином анілінфталата або аніліноксалата, нагрівають при 105-110 Вє С. При обробці хроматограми анілінфталатом глюкоза і галактоза проявляються протягом 5 хв. при 105 В° С у вигляді жовтувато-коричневих плям; плями пентоз вишнево-червоного кольору. Мальтоза і лактоза дають жовто-коричневі плями при нагріванні протягом 20 хв. при 105 Вє С. При прояві аніліноксалатом (110 В° С, 5-6 хв.) Плями Альдози мають коричневе забарвлення. Проявлені контрольні смуги (а), (б) і (в) прикладають до основної частини хроматограми (в) і таким чином визначають положення плям окремих цукрів на смузі (в), не проявляючи її. Ділянки папери, що містять не проявлені плями глюкози, фруктози, сахарози і олігосахаридів, вирізують, розрізають на маленькі шматочки (В«локшинуВ») і елююють цукру водою три рази по 30 хв. при 60-70 В°. Елюат фільтрують через маленькі паперові фільтри, випарюють на водяній бані до невеликого обсягу, знову фільтрують і доводять до певного об'єму. У розчині визначають вміст цукру з допомогою антронового реактиву.
Визначення відновлюють цукрів колориметричним методом (за І. С. Лур'є) br/>
Метод заснований на взаємодії відновлюють цукрів при нагріванні зі стандартним лужним розчином червоної кров'яної солі. При цьому її частина відновлюється в жовту кров'яну сіль.
З 6 Н 12 Про 6 + 2K 3 [Fe (CN) 6 ] + 2KOH = СН 2 ВІН (СНОН) 4 СООН + 2K 4 [Fe (CN) 6 ] + Н 2 Про
Надлишок феррицианида визначають на фотоелектроколориметри по характерному поглинанню в області 420 ... 440 нм (синій світлофільтр). Розрахунок відновлюють цукрів ведуть по калібрувальної кривої. Метод зручний для серійних аналізів і застосуємо в тих випадках, коли випробуваний розчин не містить інших речовин, що взаємодіють з ферріціанідом, а також речовин, мають поглинання в даній області спектра. При роботі з біологічним матеріалом, досліджувані витяжки бувають дуже складні за своїм складом, часто опалесціюючий, тому потрібна певна підготовка зразка. Метод дуже зручний для вивчення накопичення відновлюють цукрів під дією ферментів, гидролизующих вуглеводи, в експериментах, що моделюють технологічний процес. У цьому випадку дослідника цікавить не абсолютне зміст відновлюють цукрів, а їх збільшення за рахунок ферментативної реакції. При цьому чинники, що впливають на величину оптичної щільності, нівелюються контрольними або нульовими вимірами.
Реактиви і матеріали: а) 1%-ний розчин феррицианида (10 г на 1 дм 3 ). б) 1,25 н. розчин КОН (70 г на 1 дм 3 ). в) 1%-ний вихідний розчин глюкози. г) 0,1%-ний і 0,2%-ний робочі розчини глюкози.
Хід роботи.
1.Виполненіе аналізу: У конічну колбу на 100 см 3 вносять 10 см 3 розчину феррицианида, 5 см 3 розчину лугу та від 1 до 5 см 3 випробуваного розчину. Якщо обсяг проби менше 5 см 3 , то відсутню кількість компенсують водою. Колбочку прикривають годинниковим склом і на слабкому вогні доводять до кипіння. Кип'ятять рівно 1 хвилину. Потім вміст колби охолоджують до кімнатної температури і вимірюють оптичну щільність на ФЕК при синьому світлофільтрі (420 нм). Кількість цукру у випробуваному розчині ...
