кул імуноглобулінів різної будови, призводить до отримання сорбенту, в якому містяться антитіла з широким діапазоном спорідненості до його виділяє білку-антигену. Це ускладнює його сорбцію і особливо десорбцію, так як дисоціація цілого набору неоднакових комплексів антиген-антитіло може зажадати варіації умов алюціі в досить широкому інтервалі, аж до вельми жорстких. Це ускладнення знімається, якщо доступні моноклональні антитіла, представляють собою однорідні молекули імуноглобуліну. Десорбція і в цьому випадку може доставляти деякі труднощі через міцності комплексу, однак їх вдається подолати, пригнічуючи Нековалентні взаємодії між виділеним білком і імуноглобуліном за допомогою зміни рН, іонної сили, додавання в елюент органічних розчинників або сечовини.
іммуносорбція особливо доречна як високоспецифічний метод виділення невеликих кількостей особливо цінних білків із складних сумішей, оскільки використовувані сорбенти дороги і недовговічні через схильність імуноглобулінів до денатурації. Дуже важливо, що до іммуносорбціі можна вдатися навіть у таких випадках, коли відомості про властивості білка, в тому числі і про його функції, мізерні. Якщо відома первинна структура, визначена за нуклеотидної послідовності гена, то можливо синтезувати ряд фрагментів його пептидного ланцюга і, приєднавши їх до білка-носія, імунізувати таким кон'югатом тварину. Це дає можливість отримати антитіла до досліджуваного білку, незважаючи на те що він не тільки не виділено, але і його функція поки невідома. Імуносорбент, синтезовані приєднанням таких антитіл до придатному носію, дозволяють виділити білок.
Перспективи використання білкової інженерії для виділення білків
Методи генної інженерії дозволяють приєднувати до структурного гену білка послідовності, що кодують такі білки або їх фрагменти (домени), які полегшують виділення конструкції в цілому. Отриманий гібридний ("Химерний") білок в багатьох випадках, хоча і не завжди, життєздатний, причому обидві частини "химери" не залежно один від одного згортаються в компактні структури. Це дає можливість, використовуючи характерні властивості приєднаної до цільового білку структури, провести специфічне виділення гібрида, після чого розщепити "шарнір", з'єднує обидві його частини.
Так, білки-гібриди, у яких однією зі складових частин є білок А стафілококів, можуть бути очищені хроматографії на колонках, містять приєднані ковалентно імуноглобуліни. Білок А міцно зв'язується з останніми. Гібридні білки, до складу яких входить ОІ-галактозидаза або її великі фрагменти, можуть бути очищені на колонках, специфічно сорбирующих цей фермент, наприклад містять ковалевтно пов'язаний аналог субстрату - амннофенілтіогалактозід. По завершенні очищення гібридний білок піддають обмеженому протеолізу або розщеплюють зв'язок між об'єднаними в його структурі білками специфічними хімічними методами, наприклад дією бромціан, і відокремлюють "цільової" білок від білка-носія, що, як правило, не складає труднощів.
Іноді до структурного гену білка приєднують олігонуклеотидні фрагменти, які кодують короткі амінокислотні послідовності, що нарощують цей білок з амінного або карбоксильного кінця. Ці послідовності вибирають так, щоб вони не перешкоджали згортанню білка і в той же час повідомляли всієї конструкції те чи інше характерне властивість, яка дозволяє легко виділити таку молекулу навіть з дуже складної суміші. Потім ці фрагменти отщепляют в м'яких умовах.
Так, приєднання до карбоксильне кінця дегідрофолатредуктазу Lys-Gly-Ser-Arg-Ser двох залишків гістидину дає послідовність Lys-Gly-Ser-Arg- Ser-His-His. Сусідять залишки гістидину утворюють комплекс з іоном Ni 2 + , який утримується спеціально отриманим сорбентом з хелатирующими групами. Це дозволяє в одну стадію виділити клонований E.coli фермент із культуральної рідини практично чистим, з 90%-ним виходом. Відщеплення обох залишків гістидину карбоксипептидази А призводить до дегідрофолатредуктазу з G-кінцевий послідовністю Lys-Gly-Ser-Arg.
Запропоновано до амінів кінця рекомбінантних білків-лімфокінів приєднувати послідовність Asp-Туr-Lys-Asp-Asp-Asp-Аsр-Аsр-lys, яку пов'язує спеціально отримане антитіло. Після очищення білка (Модифікованого приєднанням такій послідовності) імнуносорбціей його обробляють ентеропептідази - ферментом, специфічно отщепляют цей пептид. Мабуть, описаний підхід особливо перспективний для виділення і очищення рекомбінантних білків.
