ю рекомбінантної плазміди pSS5, яка містить три промотора: Plac, Pt7 і Ptrp, і ген альфа-інтерферону з введеними нуклеотидними замінами. p align="justify"> Експресія інтерферону штамом E.coli SS5, що містить цю плазміду, контролюється трьома промоторами: Plac, Pt7 і Ptrp. Рівень експресії інтерферону становить близько 800 мг на 1 л клітинної суспензії. p align="justify"> Недоліком способу є низька технологічність використання ферментативного руйнування клітин, ДНК і РНК мікроорганізму і одностадійна хроматографічна очищення інтерферону. Це обумовлює нестабільність процесу виділення інтерферону, призводить до зниження його якості і обмежує можливість використання наведеної схеми для промислового виробництва інтерферону. p align="justify"> Недоліками даної плазміди і штаму на її основі є використання в плазміді сильного нерегульованого промотора фага Т7 в штамі Є. coli BL21 (DE3), в якому ген Т7 РНК полімерази знаходиться під промотором lac оперона і який завжди " ; тече ". Отже, в клітці безперервно відбувається синтез інтерферону, що призводить до дисоціації плазміди і зниження життєздатності клітин штаму, і в результаті - зниження виходу інтерферону. p align="justify"> Для отримання великих кількостей ІФН використовують шестиденні одношарові культури клітин курячого ембріона або культивовані лейкоцити крові людини, заражені певним видом вірусу. Іншими словами, для отримання ІФН створюють певну систему вірус-клітина. p align="justify"> З клітки людини ізольований ген, відповідальний за біосинтез ІФН. Екзогенний людський ІФН отримують, використовуючи технологію рекомбінантних ДНК. Процедура виділення кДНК ІФН-ів полягає в наступному:
. З лейкоцитів людини виділяють мРНК, фракционируют її за розмірами, проводять зворотну транскрипцію, вбудовують у сайт модифікованої плазміди.
. Отриманим продуктом трансформують Є. соli; утворилися клони підрозділяють на групи, які ідентифікують.
. Кожну групу клонів гібрідізіруют з ІФН - мРНК.
. З утворилися гібридів, що містять кДНК і хРНК, виділяють мРНК, проводять її трансляцію в системі синтезу білка.
. Визначають інтерферон противірусну активність кожної суміші, отриманої в результаті трансляції. Групи, що проявили інтерферон активність, містять клон з кДНК, гібридизувати з ІФН - мРНК; повторно ідентифікують клон, що містить повнорозмірну ІФН - кДНК людини. [1, 9, 29]
1.5 Перспективні дослідження в галузі отримання інтерферонів
З розвитком методів молекулярної біології, біохімії та біотехнології підвищуються вимоги якості до практично важливим продуктам, отриманим в даних областях. Одним із прикладів подібних тенденцій є підвищення чистоти фармакологічних ...
