инної тканини в парафіні.
Метою роботи є оптимізація методу виділення ДНК із зразків тканини. Відповідно до даної метою були поставлені такі завдання:
) провести порівняльний аналіз різних методів виділення ДНК,
) визначення мутацій KRAS в ДНК із зрізів пухлин, фіксованих формаліном, укладених в парафін.
Глава 2. Матеріали і методи
Клінічні зразки
Для роботи використовувалися парафінові блоки пухлинної тканини з встановленим діагнозом раку прямої або ободової кишки.
Для виділення ДНК з блоків тканини в парафіні надлишки парафіну обрізали скальпелем і готували серійні зрізи товщиною 10 мкм з площею тканини на зрізі 25-80мм 2. Якщо поверхня зразка була тривалий час експонована на повітрі, то перші 2-3 зрізу відкидали, а наступні 6-8 використовували в тісті. Перший і останній робочі знімки серії фарбували гемотоксілін-еозином, і патоморфолог оцінював відсоток пухлинних клітин.
Виділення геномної ДНК виробляли трьома способами: 1) за допомогою набору DNA Mini Kit (Qiagen, кат. № 51304), лужним методом, за допомогою набору MagneSil Genomic, Fixed System (Promega, product MD 1490) .
Реактиви
· ацетат натрію рН=5;
· геномна ДНК плаценти людини («Біолінк»);
· ізопропанол;
· барвник Sybr Green;
· праймери (послідовність праймерів для ПЛР в режимі реального часу є інтелектуальною власністю компанії «Біолінк»);
· референс-барвник флуорісцеін;
· хлороформ;
· етанол 95%;
· Smart Taq ДНК-полімераза;
· SDS;
· 0,2 мМ dATP, dGTP, dTTP, dCTP;
· 25mM MgCl 2;
· 0,2 N NaOH.
Методи
Для роботи використовувалися парафінові блоки пухлинної тканини з встановленим діагнозом раку прямої або ободової кишки.
Для виділення ДНК з блоків тканини в парафіні надлишки парафіну обрізали скальпелем і готували серійні зрізи товщиною 10 мкм з площею тканини на зрізі 25-80мм 2. Якщо поверхня зразка була тривалий час експонована на повітрі, то перші 2-3 зрізу відкидали, а наступні 6-8 використовували в тісті. Перший і останній робочі знімки серії фарбували гемотоксілін-еозином, і патоморфолог оцінював відсоток пухлинних клітин. Решта 4-6 робочих зрізу поміщали по 2 зрізу в пробірку на 1,5 мл. ДНК.
Виділення ДНК на колонках з сорбентом за допомогою набору QIAamp DNA MINI KIT
Принцип роботи набору заснований на специфічному зв'язуванні ДНК з силікатної мембраною колонки QIAamp MinElute. При цьому інгібітори ПЛР, такі як двовалентні катіони і білки, видаляються з мембрани промиванням буферними розчинами.
ДНК виділяли згідно інструкції до набору QIAamp DNA MINI KIT.
Виділення ДНК лужним методом
Виділення ДНК проводилося за методом Shi et al (2004) з модифікаціями [22].
Температура екстракції була змінена з 120? С на 95? С з подальшою екстракцією хлороформом. Осадж...
