рки з лізуючого розчином і ВКО внесли 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. У пробірку негативного контролю виділення внесли 100 мкл ОКО. У пробірку позитивного контролю виділення внесли 90 мкл ОКО і 10 мкл позитивний контрольний зразок (ПКО). Проби ретельно перемішали на вортексі і прогріли до 5 хвилин при температурі 65.
Процентріфугіровалі 5 секунд при 5 тис. об/хв на мікроцетріфуге і використовували для виділення ДНК насадочное рідина, перенісши її в нову пробірку. Ретельно ресуспендіровалі сорбент універсальний на вортексі. У кожну пробірку окремим наконечником додали по 25 мкл ресуспендованого сорбенту універсального. Перемішали на вортексі, поставивши в штатив на 2 хвилини, ще раз перемішати і залишити в штативі на 5 хвилин. Обложили сорбент універсальний в пробірках центрифугуванням при 5 тис./Об протягом 30 сек. Видалили насадочное рідина, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби. Повторюючи процедуру відмивання, видалили насадочное рідина повністю. Пробірки помістили в термостат при температурі 65 на 5 хвилин, періодично струшуючи на вортексі. Процентріфугіровалі пробірки при 12 тис. Об/хв протягом 1 хвилини на мікроцентрифузі. Насадочное рідина містить очищену ДНК. Даний метод виділення дозволяє отримати концентрацію ДНК в кінцевому розчині до 30 мкг/мл. ДНК з біопроб виділяли за допомогою комерційних наборів АмпліСенс - ДНК-сорб-В raquo ;, складу якого наведено в таблиці 3.
Таблиця 3 - Склад набору для виділення ДНК
РеактівОпісаніеВаріант 50Варіант 100Об'ем (мл) К-воОб'ем (мл) К-воЛізірующій растворПрозрачная безбарвна рідина 151 флакон301 флаконРаствор для відмивання 1Прозрачная безбарвна рідина 151 флакон301 флаконРаствор для відмивання 2Прозрачная безбарвна рідина 501 флакон1001 флаконСорбент універсальнийСуспензія білого цвета1,251 пробірка1,252 пробіркаTE - буфер для елюції ДНКПрозрачная безбарвна рідина 5,01 пробірка5,02 пробірка
. 2 Проведення ПЛР з метою отримання коротких амплікон
Для проведення ПЛР використовували ампліфікатор роторного типу Rotor Gene raquo ;. Програма ампліфікації, яка задавалася на приладі, включала в себе наступне (таблиця 4):
Таблиця 4 - Параметри проведення ПЛР з допомогою Rotor Gene
ЕтапТемператураПродолжітельность етапаІзмереніе флуоресценцііКолічество цікловПлавленіеHold/Утримувати. темп5015 хв - 1Hold/Утримувати. темп9515 хв - 1Отжіг праймеровCycling1/Ціклірованіе955 с - 56020 с - 7 215 с-Накопичення концентрації ампліконовCycling2/Ціклірованіе955 с - 406020 сFAM/Green, JOE/Yellow ROX/Orange Cy5/Red7215 с -
На першому етапі відбувається розплітання вторинної структури ДНК (плавлення) протягом 30 хвилин. На другому етапі до певних ділянок ДНК приєднуються праймери (отжиг праймерів). На заключному етапі за допомогою що знаходиться в розчині полімерази відбувається накопичення ділянок ДНК, обмежених праймерами.
2.3 Схема установки і режим опромінення зразків
Для обробки ДНК розчину і розчину білка ЕМП низьких частот, було використано спеціальне обладнання, блок-схема якої представлена ??на малюнку 9. Вона складається з генератора ГЗ - 118, котушки індуктивності, що має 1 200 витків і екранованої камери. Вектор магнітної індукції ЕМП, створюваного котушкою, становить 30 млТл, питомий опір котушки 320 Ом, і напруга на котушці дорівнює 14 В.
- генератор ГЗ - 118, 2 - екранована камера, 3 - котушка індуктивності, 4 - досліджуваний зразок.
Рисунок 9 - Блок-схема установки для впливу ЕМП НЧ на ДНК і білки.
Нужная частота виставлялася на панелі генератора низькочастотних сигналів ГЗ - 118, який передавав сигнал, з необхідними характеристиками, на котушку. Екранована камера була необхідна для локалізації магнітного поля, створюваного котушкою всередині камери, і ослаблення його характеристик за межами камери. Еппендорф з досліджуваними зразками (ДНК розчин, білковий розчин), містилися в екрановану камеру, в якій розташовувалася котушка індуктивності, і піддавалися впливу ЕМП НЧ. Температура, при якій виробляли опромінення, становила 23-25 ??0 С. По закінченню даного часу вміст Еппендорфа моментально було переміщено в кювету хемілюмінометре для реєстрації впливу електромагнітного поля даної частоти, що викликав стимуляцію до протікання екзотермічних реакцій окислення з виділенням енергії у вигляді потоку фотонів, що і представляє з себе явище хемілюмінесценції.
. 3.1 Пристрій хемілюмінометре
хемілюмінометре - апаратно-програмний комплекс, призначений для реєстрації та аналізу надслабких світлових потоків, супроводжуючих хім...
