анняВ») і з функціональними групами білків та інших біомолекул, що також веде до змін клітинних функцій. p align="justify"> Розвитку вільнорадикальних реакцій окислення ліпідів сприяють прооксіданти, а стримують його інгібітори - антиоксиданти. До останніх відносяться ? - токоферол, селен, деякі гормони (тироксин, стероїдні) і т.д. Від шкідливої вЂ‹вЂ‹дії гідропероксидів ліпідів клітку захищає ферментна система глутатіонпероксидази, що руйнує ці речовини.
Для дослідження процесів пероксидного окислення ліпідів використовуються методи: а) визначення продуктів пероксидного окислення ліпідів, б) реєстрації вільних радикалів в ході реакції, в) визначення антіокислітельной (антиоксидантної) активності тканин. p align="justify"> Перші два найбільш прості для виконання і знайшли широке застосування, зокрема, метод визначення найбільш вивченого продукту пероксидного окислення - малонового діальдегіду.
Робота 107. Визначення чутливості еритроцитів до пероксидного гемолізу
Реактиви. Фосфатний буфер, 1М розчин з рН 7,4 *; хлорид натрію, як 170 г/л розчин; робочий свіжоприготований розчин хлориду натрію, об'єм суміші доводять до 1 л і перед вживанням насичують киснем повітря шляхом струшування; фосфатний буфер, 0,17 М розчин з рН 7,4 х; розчин гідрохлориду натрію, приготований на фосфатному буфері (0,17 М фосфатний буфер і 1%-ний розчин NaCl у співвідношенні 1:3 за об'ємом); ізотонічний спиртовий розчин ергокальциферолу Д2 (продажний препарат 0,5% - ного спиртового розчину ергокальциферолу розбавляють в 50 разів розчином гідрохлориду натрію на фосфатному буфері); аміачний розчин (розчиняють 1 мл концентрованого розчину аміаку в колбі місткістю 250 мл); ацетат ? - токоферолу, 5%-ний масляний розчин.
Обладнання. Штатив із пробірками; піпетки місткістю 0,1; 5 і 10 мл; скляні палички; центрифуга з Центрифужна вагами; термостат, відрегульований на 38? С; ФЕК або спектрофотометр. p align="justify"> Матеріал. Кров, взята з пальця. p align="justify"> а. Визначення спонтанного гемолізу по Ягер. Метод заснований на визначенні при 540 нм екстинкції внеерітроцітарного гемоглобіну, що надходить в середу внаслідок спонтанного лізису мембран еритроцитів, викликаного пероксидним окисленням ліпідів киснем повітря. p align="justify"> Хід визначення. У пробірку з 7,5 мл робочого розчину хлориду натрію додають 0,1 мл крові. Готують суспензію еритроцитів, втягуючи і видуваючи рідина за допомогою піпетки. p align="justify"> Центрифугують суспензія 10 хв при 1000 об/хв, надосадову рідину обережно відсмоктують. До осаду еритроцитів додають 7,5 мл робочого розчину хлориду натрію і знову приготування суспензії тим же способом. p align="justify"> У три центрифужні пробірки наливають по 1 м приготовленої суспензії: у перші дві пробірки додають по 4 мл робочого розчину хлориду натрію; а в третю - 4 мл дистильованої води (для повного гемолізу). Проби перемішують скляною паличкою і ставлять на 2 год у термостат при 38? С.
По закінченні інкубації вміст пробірок перемішують, центрифугують 10 хв при 1000 об/хв і вимірюють екстинкцію всіх проб проти дистильованої води на ФЕК або спектрофотометрі при 540 нм (світлофільтр зелений) в кюветі з товщиною шару 1 см.
Розрахунок проводять за формулою
(Е1 + Е2) 100
х = --------
2Е3
де х - ступінь гемолізу,%;
Е1 і Е2 - екстинкції першої та другої проб;
Е3 - екстинкція третьої проби.
б. Дослідження гемолітичного дії вітаміну D2 (ергокальциферолу) за В.Б.Спірічеву і Н.В.Блажеевіч. Метод заснований на визначенні при 540 нм екстинкції внеерітроцітарного гемоглобіну, вихід якого посилюється за допомогою вітаміну D2, що запускає пероксидне окислення ліпідів в мембранах еритроцитів. ? - токоферол як антиоксидант зменшує гемолітичну активність ергокальциферолу.
Хід визначення. У три пробірки вносять по 0,1 мл крові. В одну попередньо наливають 4 мл ізотонічного розчину ергокальциферолу (прооксіданти), а в іншу - той же об'єм розчину ергокальциферолу і 1 краплю розчину ацетату ? - токоферолу (антиоксидант), в третю - 4 мл розчину хлориду натрію на фосфатному буфері (контроль).
приготування суспензії еритроцити у всіх пробах, втягуючи і видуваючи рідина за допомогою піпетки, і залишають стояти при 20-22? С. Через 30 хв проби центрифугують протягом 10 хв при 3000 об/хв, відбирають 0,1 мл надосадової рідини в три чисті пробірки і додають у них по 5 мл аміачного ро...
