200 М - 1? см - 1, в розрахунках вікорістовувалі величину мілімолярного коєфіцієнта екстінкції, вираженість як 22,2 см - 1
? мкмоль - 1;
С - концентрація бiлка.
Отрімані результати віражалі в мкмоль Н 2 О 2/хв мг Білка.
.4 Визначення актівності глутатіонпероксідазі
Мірою актівності ферменту глутатіонпероксідазі є ШВИДКІСТЬ окиснення глутатіону в прісутності гідропероксіду третина бутилу (Моін В.М., 1986).
реактиви:
1. Тріс-НСl буфер 0,1 М (рН 8,5).
. Тріс-НСl буфер 0,1 М (рН 8,5), Який містіть 6 мМ ЕДТА та 12 мМ азид натрію. Безпосередно перед аналізом на цьом буфері готувалі 4,8 мМ розчин відновленого глутатіону.
. Гідропероксід третина бутилу 20 мМ (готувалі перед аналізом розведения вихідного реактиву в 500 разів).
. ТГО (20%).
. Реактив ЄЛМА - 0,01 М (3,96 м ? л - 1) ДТНБК на метанолі.
Хід визначення.
мкл гомогенату інкубувалі Із 830 мкл реактиву 2 впродовж 10 хв при 37 ° С, додавали 70 мкл реактиву 3 та інкубувалі 5 хв. Реакцію зупінялі Додавання 0,2 мл холодної ТГО, осаджені Білки видалялися центрифугування при 8000 об/хв. До 100 мкл супернатанту додавали 10 мл трис-НСl буферу (реактив 1) та 100 мкл реактиву ЄЛМА. Через 5 хв проби фотометрувалі у кюветі Із довжина оптичного шляху 1 см при 412 нм.
Контрольна проба відрізнялася тім, что дослідний зразок вносили безпосередно перед осадженим білків. Із урахуванням розведення біологічного матеріалу в даній методіці и коефіцієнта молярної екстінкції ТНФА при 412 нм - 11400, розраховувалі Активність ГПО в мкМ використанн в Реакції субстрату за формулою:
мкмоль G-SH/хв? мг Білка,
де А ГПО - Активність глутатіонпероксідазі;
? Е - Різниця екстінції за годину Реакції;
? - обєм трис-HCl буфера, гідропероксіду трет-бутилу, розчинна ТГО;
b - обєм супернатанту, трис-HCl буфера та реактиву ЄЛМА;
? - молярна коефіцієнт екстінкції тіонінтрофенільного аніона, дорівнює 11400 М - 1 · см - 1, у розрахунках вікорістовувалі мілімолярній коефіцієнт екстінкції, вираженість як 11,4 см2/мкмоль;
V super - обєм супернатанту (0,02 мл);
V тк.фр - обєм тканінної Фракції;
t - година Реакції;
С - концентрація Білка, мг/мл;
? - обєм проби, якові вносячи у кювету;
l - довжина оптичного шляху (1 см)
Отрімані результати віражалі в мкмоль G-SH/хв? мг Білка.
3. Результати та їх Обговорення
Серед різніх процесів и явіщ, Які проходять в оточуючому середовіщі, Важлива місце займають окисно-віднові Реакції. Например, Такі жіттєво Важливі процеси, як дихання и фотосинтез включаються Стадії окиснення и Відновлення. Процеси руйнування забезпечують основнову часть енергоспоживання живого.
При підшкірному введенні гістаміну на третю добу досліду нами відмічаліся алергічні Реакції у щурів, Які проявлялися почервонінням слізовіх оболонок та вушок, сльозоточівістю очей, значний «вміванням» щурів. Проти Вже до сьомої доби Такі вияви були Менш часто.
3.1 Активність супероксиддисмутази у нірці щура за Дії гістаміну
При вівченні актівності СОД у нірці за Дії гістаміну, концентрацією 8 мкг/кг на 1 добу досліду ее Активність растет на 28%, з рівнем достовірності р? 0,95 (рис. 10). Супероксиддисмутаза - антиоксидантний фермент, Який каталізує Наступний реакцію: О 2? + Е? + 2Н +? Н 2 О 2.
Рис. 10 Активність супероксиддисмутази у нірці щура за Дії гістаміну, концентрацією 8 мкг/кг, на 1-у добу досліду (* - р? 0,95).
На Сьоме добу досліду за Дії гістаміну у концентрації 8 мкг/кг, відбувається достовірне зростання актівності СОД у Нирко щурів відносно контролю (рівень достовірності - р? 0,95) (рис. 11). При вівченні Дії гістаміну концентрацією 1 мкг/кг, як и на Першу добу досліду, нами не виявлено зростання актівності досліджуваного ферменту.
Рис. 11 Активність супероксиддисмутази у нірці щура за Дії гістаміну, концентрацією 8 мкг/кг на 7 добу досліду (* - р? 0,95).
На 14 добу досліду у нірці щура за Дії гістаміну у концентрації 1 мкг/кг Активність супероксиддисмутази начинает зростаті відносно контролю на 36% (рівень достовірності - р? 0,99) (рис. 12).
