ьому експериментальний підхід, що отримав назву ЗС ("три ЦЕ» - chromosome conformation capture), полягає в тому, що із зшитих формальдегідом ядер видаляють гістони, після чого ДНК обробляється рестриктазами і лигируется по липким кінців. Зрозуміло, що ймовірність лигирования вільно дифундують в розчині фрагментів ДНК вкрай мала. У той же час імовірність лигирования фрагментів, пов'язаних один з одним за допомогою білків, буде значно вищою.
Рис 9. Модель дії енхансера
На малюнку показані основні обговорювані в даний час моделі взаємодії енхансера (enh) і промотора (pro). А - пряму взаємодію при випетліваніі району між енхансером і промотором; Б - опосередковане, або скануючий, випетліваніе (на відміну від попереднього варіанту, при якому взаємодія промотору та енхансера відбувається «відразу»); В - поширення якогось активуючого сигналу; Г - наближення енхансера до промотор якимось додатковим механізмом (наприклад, білками, укладають хроматин між енхансером і промотором в компактну структуру).
Відповідні відмінності можуть бути зареєстровані з використанням кількісної або полуколичественной полімеразної ланцюгової реакції (рис. 10). За допомогою цього експериментального підходу було продемонстровано пряму взаємодію LCR-домену?-глобінових генів миші з промоторами глобінових генів. Було також показано, що структура активують комплексів змінюється при переході домену з потенційно активною в активну форму (рис. 11). Аналогічні спостереження були зроблені і при вивченні ряду інших геномних локусів. Виявлено також випадки участі в утворенні складного активаторного комплексу (chromatin hub) регуляторних елементів, розташованих на різних хромосомах. Такі міжхромосомні взаємодії можуть відігравати важливу роль у координації експресії пов'язаних у функціональному відношенні генів, які розташовуються на різних хромосомах.
Слід зазначити, що модель освіти прямого активаторного комплексу за участю промоторів і віддалених енхансером не виключає можливості подальшого обмеженого поширення активуючого сигналу, т. е. створення активного хроматинового домена, що характеризується підвищеним рівнем ацетилювання гістонів.
Рис. 10. Принцип методу ЗС
В основі методу лежить лігування рестріктних фрагментів, зафіксованих ДНК-білковими сшивками, при низькій концентрації ДНК. Клітини (А) обробляють формальдегідом, що призводить до утворення білок-білкових і ДНК-бел- кових зшивок (Б). Потім клітини лизируют, осаджують хроматиновими фракцію і детергентом відмивають незв'язані білки. Отримані ДНК-білкові препарати (В) обробляють рестриктазами (Г) - Отриманий препарат сильно розбавляють. Завдяки розбавленню фрагменти ДНК виявляються ізольованими один від одного, крім тих, які залишилися об'єднані білковими сшивками. Очевидно, що це Moiyr бути тільки ділянки ДНК, які спочатку in vivo входили до складу будь-яких великих надмолекулярних комплексів. Потім в отриманий розбавлений препарат додають лігази. У цих умовах лігірована можуть тільки просторово зближені рестрікгние фрагменти - т. Е. Тільки фрагменти, об'єднані білковими сшивками (Д) - іншими словами, взаімодействовашіе in vivo. Після лігування виділяють ДНК і детектируют продукти лигирования
Рис. 11. Формування єдиного активаторного комплексу
На прикладі домену а-глобінових генів курей показано, як активація домену відбивається на його просторової організцією. Домен а-глобіно- вих генів курей (А) включає три гени - ембріональний п і дорослі aD і аА. Крім генів, до складу домену входять регуляторні елементи: головний регуляторний елемент (MRE - main regulatory element, аналог галузі контролю локусу), ділянка гіперчутливості до ДНКаза, розташований на відстані 9 т. П. Н. перед геном п («- 9» HS), CpG-острівець і енхансер (enh), розташований після гена ор. В не-еритроїдних клітинах взаємодій між різними функціональними елементами домену практично немає (Б). У не- диференційованими попередниках еритробластів спостерігаються окремі взаємодії між деякими елементами, причому можливо кілька варіантів таких взаємодій (В). Нарешті, в зрілих еритробластах практично всі регуляторні елементи, поряд з промоторами транскрібіруемих генів, об'єднані в структуру, що отримала назву «хроматиновий хаб» (chromatin hub) (Г). Стрілками показаний напрям транскрипції працюють генів.
В останні роки активно обговорюється модель, що зв'язує активацію транскрипції з переміщенням гена з неактивного в активний ядерний компартмент. Прикладом активного компартмента можуть служити PML-тільця. Це невеликі компартменти, що містять PML-білки і ряд транскрипційних факторів, найбільш активні генні домени випетліваются з хромосомних територій. Показано, що при цьому вони переміщуються до PML-тільцям, що, мабуть, спри...
